Detection of queuosine and its precursors in tRNA by nanopore RNA sequencing and analysis of interactions between Q34 and ms2i6A/i6A37 modification

Queuosin (Q) ist eine komplexe tRNA-Modifikation an der Wobble-Position 34 von NAC/U-dekodierenden tRNAs. Q beeinflusst Translationsgeschwindigkeit und -genauigkeit, ist jedoch unter Standardbedingungen nicht essenziell für die Lebensfähigkeit, sodass seine physiologische Bedeutung weiterhin unvollständig verstanden ist. In dieser Arbeit wurde direkte tRNA-Sequenzierung mittels Nanopore-Technologie zur Detektion von Q und seinen Vorstufen preQ1 und preQ0 eingesetzt. In vitro transkribierte tRNAs sowie aus Schizosaccharomyces pombe und Escherichia coli isolierte tRNAs wurden mit 5′- und 3′-Adaptern ligiert, um eine vollständige Sequenzierung zu ermöglichen. Der Vergleich modifizierter und unmodifizierter tRNAs mit JACUSA2 zeigte erhöhte Fehlerraten an und um die Q-Position. E. coli-Stämme mit Defekten in der Q-Biosynthese ermöglichten zudem die Unterscheidung von Q, preQ1 und preQ0 anhand charakteristischer Fehlerratenprofile. Damit kann Nanopore-Sequenzierung Q-verwandte tRNA-Modifikationen mit Einzelbasenauflösung nachweisen. Zusätzlich wurde die funktionelle Wechselwirkung zwischen Q34 und A37-Modifikationen in tRNATyr untersucht. In E. coli führte der gleichzeitige Verlust von Q34 und ms²i⁶A37 zu synthetischen Wachstumsdefekten, erhöhter Frameshifting-Rate an Tyrosin-Codons und veränderter Proteinaggregation unter Stress. Diese Phänotypen wurden durch Überexpression von tRNATyr teilweise kompensiert. Eine konservierte Interaktion wurde auch in S. pombe beobachtet, wo der kombinierte Verlust von Q34 und i⁶A37 das Wachstum unter Rapamycin beeinträchtigte und ebenfalls durch tRNATyr-Überexpression teilweise verbessert wurde. Zudem reduzierte Q34 den i⁶A37-Spiegel in tRNATyr um etwa 17,5 %. Insgesamt etabliert diese Arbeit Nanopore-Sequenzierung als leistungsfähige Methode zur Q-Detektion und zeigt, dass Q besonders wichtig wird, wenn andere Modifikationen der Anticodonschleife fehlen.