Investigating Human Cardiac Long Non-Coding RNA Using Pooled CRISPR Screening with Single-Cell RNA Sequencing Readout

Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNA) sind primär durch ihre strukturelle Eigenschaften aktiv, etwa bei der Regulation der Genexpression. In den letzten Jahren wurde deutlich, dass zahlreiche lncRNAs, ursprünglich als nicht-kodierend eingestuft, tatsächlich in Mikroproteine (< 100 Aminosäuren) übersetzt werden können, ein Phänomen, das auch im menschlichen Herzen auftritt. Während einige konserviert sind, entstanden die meisten erst kürzlich in der menschlichen Evolution. Dennoch sind die Rollen vieler lncRNAs und ihrer Mikroproteine unzureichend charakterisiert. Zur Aufklärung ihrer Funktionen im Herzen etablierte ich ein CRISPR-basiertes Screening mit Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) in aus induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Kardiomyozyten (hiPS-CMs). Solche Screens ermöglichen multiple genetische Perturbationen in Zellpopulationen sowie eine hochauflösende Analyse der transkriptionellen Effekte. Um das Screening umzusetzen, adressierte ich zentrale Herausforderungen: Ich validierte ein hiPS-CM-Modell mit stabiler dCas9-Expression, untersuchte die metabolische Reifung, verglich Einzelzell- mit Einzelzellkern-Sequenzierung und zeigte, dass eine gezielte Amplifikation für die Detektion von single guide RNAs (sgRNA) essenziell ist. Ich etablierte Kriterien zur sgRNA-Zuordnung, identifizierte Kontaminationsquellen und Schwellenwerte zum Filtern valider Zellen mittels CRISPR-Interferenz (CRISPRi). Aus diesem Screening identifizierte ich differentiell exprimierte Gene für 116 lncRNAs, wobei für 47 signifikante Gene-Ontologie-Terme vorlagen. Etwa die Hälfte scheint an kardialer Entwicklung oder Kontraktion beteiligt zu sein. Diese lncRNAs sind teils herzspezifisch und kodieren oft für potenziell stabile Mikroproteine. Ich schließe daraus, dass zahlreiche im Herzen exprimierte lncRNAs kardiale Funktionen besitzen, unabhängig von Spezifität und evolutionärem Alter. Konkrete Effekte auf die Kontraktion werden in mittels Calcium-Flux-Assay untersucht.