Phosphopeptides as tools to probe the recognition of the RNA-Polymerase II C-Terminal domain by phospho-specific antibodies

Die C-terminale Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II ist ein zentraler Transkriptionsregulator, gesteuert durch dynamische posttranslationale Modifikationen (PTMs) einer 52-fach wiederholten Heptad-Sequenz (-YSPTSPS-). Phosphorylierung ist die primäre Modifikation, doch das Verständnis der Interaktion zwischen Modifikationen bleibt lückenhaft. Dies liegt primär am schwierigen Zugang zu präzise modifizierter CTD, was die Validierung phosphospezifischer Antikörper einschränkt. Diese Arbeit entwickelt eine Plattform basierend auf der chemischen Synthese von Phosphopeptiden, um den Einfluss von CTD-Multiphosphorylierung auf die Antikörpererkennung systematisch zu untersuchen. Eine robuste Strategie zur Synthese diverser, langer multiphosphorylierter Peptide wurde durch Optimierung der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) etabliert. Ein Protokoll für die parallele, HPLC-freie Aufreinigung von Sonden und deren ELISA-Immobilisierung wurde eingeführt. Eine Bibliothek CTD-ähnlicher Peptide mit bis zu 6 Phosphorylierungen und 12 Heptaden wurde mittels SPPS und chemischer Ligation (NCL) erstellt. Die Evaluierung von über 60 Sonden gegen drei monoklonale Anti-pS2-Antikörper zeigte signifikante Bindungsvariabilität. „Bystander“-Phosphorylierungen nahe dem pS2-Epitop zeigten komplexe Effekte und verstärkten oder reduzierten die Erkennung positionsabhängig. Entgegen der Hypothese, dass Multivalenz die Bindung via Chelatisierung verstärkt, wurde keine Brückenbindung festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass die intrinsische CTD-Flexibilität kooperative Bindung limitiert. Zudem führten Epitop-Cluster und Modifikationsvariationen zu unterschiedlichem Verhalten äquivalenter Antikörper. Diese Arbeit zeigt das unvorhersehbare, durch Multiphosphorylierung beeinflusste Bindungsverhalten phosphospezifischer Antikörper und betont den Bedarf umfassender Charakterisierungen. Eine zuverlässige Plattform aus chemischer Synthese und Bindungsassays wird hierfür bereitgestellt.