Dual illuminations to modulate photobleaching and phototoxicity of fluorescent proteins in fluorescence imaging

L'imagerie de fluorescence est très utilisée en sciences du vivant pour suivre des processus biologiques in vivo, le plus souvent avec des protéines fluorescentes (FPs) comme sondes. Elle souffre néanmoins de limitations, dues notamment à la photodégradation des espèces fluorescentes par la lumière excitatrice : le photoblanchiment. L'état excité triplet des fluorophores est un intermédiaire clé de ce processus. Nous présentons dans la 1ère partie de cette thèse une nouvelle méthode permettant de ralentir le photoblanchiment des FPs vertes et jaunes d'un facteur ~4. Notre approche exploite un processus photophysique appelé croisement intersystème inverse (reverse intersystem crossing, RISC) pour dépeupler l'état triplet avec de la lumière. Afin d'induire le RISC, nous co-illuminons les FPs vertes et jaunes au maximum d'absorption de leur état triplet à ~900 nm, pendant leur excitation visible. Cette méthode est efficace in vitro comme in vivo, en cellules eucaryotes et procaryotes. Dans une 2e partie, nous caractérisons spectroscopiquement l'état triplet des FPs rouges et montrons qu'une co-illumination au niveau de son maximum d'absorption à ~730 nm, pendant l'excitation visible de la FP, conduit cette fois-ci à une accélération du photoblanchiment. Après avoir construit un modèle photophysique rendant compte de cette observation, nous mettons au point des dispositifs microfluidiques destinés à évaluer l'impact de la co-illumination proche infrarouge sur la production par les FPs rouges d'espèces réactives de l'oxygène (reactive oxygen species, ROS). Les ROS sont en effet connus pour être des sous-produits du photoblanchiment. Ce travail pourrait conduire à l'avenir au développement de photosensibilisateurs génétiquement encodés plus performants pour les applications en optogénétique.