Ingénierie du génome et du surfaceome du pathogène bovin Mycoplasma bovis : premières étapes vers la construction d’un châssis vaccinal

Face à la croissance démographique mondiale, le secteur agricole doit intensifier sa production tout en maintenant une approche durable. Parmi les obstacles rencontrés, la recrudescence des maladies infectieuses dont celles causées par les mycoplasmes. Parmi eux, Mycoplasma bovis a un impact considérable, lié aux pertes de production et à l’atteinte à la santé et au bien-être animal. M. bovis est responsable d’un large éventail de maladies à forte morbidité chez les bovins, et est un agent clé impliqué dans le complexe des maladies respiratoires bovines (BRDC), le principal problème sanitaire de l’élevage bovin. La lutte contre M. bovis se heurte à de nombreux obstacles, dont l’augmentation des résistances aux antibiotiques et la protection limitée offerte par les vaccins actuels.Nos travaux s’inscrivent dans le cadre du projet ANR RAMbo-V (Rational Approach to a Mycoplasma bovis vaccine), dont l’objectif est de développer les connaissances et outils nécessaires à la conception d’une souche vaccinale exprimant des antigènes protecteurs.La première partie de ce manuscrit est consacrée à l’amélioration d’un outil d’édition de base dérivé des systèmes CRISPR. Il repose sur une protéine hybride Cas9–désaminase qui permet la désamination ciblée de cytosines et la génération de codons stop prématurés causant l’inactivation de gènes d’intérêt. Ces travaux sont menés en parallèle sur deux souches: PG45, souche de référence, et RM16, une souche de terrain isolée par INRAE. Cette première partie, présentée sous la forme d’un article pré-publié, met l’accent sur les améliorations apportées à l’outil existant : ciblage multigénique, élimination de l’éditeur de base CRISPR des mutants générés, élargissement du spectre des gènes ciblables. Cette partie inclue également la présentation des différents mutants générés, accompagnée, lorsque cela était possible, de tests phénotypiques. Enfin, nous évaluons la spécificité et les limites de ces outils par séquençage complet du génome des mutants obtenus, mettant en évidence des mouvements intra-génomiques de séquences d’insertion ainsi que des désaminations hors cible potentielles.La seconde partie de ce travail explore l’utilisation des outils développés pour moduler l’expression des protéines de surface chez M. bovis. Nous nous focalisons sur le ciblage de l’un des principaux facteurs de virulence de M. bovis, impliqué dans l’échappement au système immunitaire. Le locus des protéines de surface variables (Variable Surface Proteins, Vsp) permet en effet une variation antigénique par l’expression différentielle de lipoprotéines hautement immunogènes. Les Vsp constituent un élément majeur du surfaceome de M. bovis, et ce mécanisme de variation antigénique est considéré comme l’un des obstacles majeurs à l’efficacité de la réponse immunitaire. Afin d’avancer vers la conceptualisation d’un vaccin synthétique, nous avons bloqué la variation des Vsp en ciblant la recombinase spécifique Xer et avons tenté d’empêcher totalement l’expression de toute Vsp, ceci afin de libérer la surface cellulaire pour l’expression hétérologue de protéines susceptibles de favoriser, à terme, une réponse immunitaire efficace. Nos résultats indiquent que l’expression d’au moins une protéine Vsp pourrait jouer un rôle dans l’aptitude de M. bovis à se développer en milieu axénique.Les résultats obtenus montrent les possibilités offertes par ces outils, mais aussi leurs limites et les obstacles spécifiques liés à l’instabilité génomique de la souche M. bovis PG45. Ils montrent l’importance du choix des souches utilisées dans la conception de nouveaux vaccins et la nécessité de contrôler la stabilité génomique pour assurer une maîtrise de la présentation des antigènes protecteurs à la surface des cellules. En conclusion, nos travaux permettent d’élargir la boite à outils pour l’ingénierie génomique et la génomique fonctionnelle chez M. bovis et ouvre la voie à une adaptation de ces outils à d’autres mycoplasmes.