Analysis of Cohesion Establishment During DNA Replication Using eSPAN

La replicación del ADN es el proceso mediante el cual las células generan copias idénticas de su genoma. Tras la replicación, las dos cromátidas hermanas generadas se mantienen unidas por el complejo cohesina. El establecimiento y el mantenimiento adecuados de la cohesión entre cromátidas hermanas son fundamentales para una correcta segregación cromosómica durante la mitosis. Aunque la cohesina puede asociarse a la cromatina a lo largo de todo el ciclo celular, la cohesión se establece durante la replicación del ADN. A medida que avanzan las horquillas de replicación, la cohesina pasa de rodear una única molécula de ADN (ADN no replicado) a atrapar ambas cromátidas hermanas. Diversas proteínas asociadas al replisoma participan en el establecimiento de la cohesión. Se cree que promueven el atrapamiento de las cromátidas hermanas ya sea mediante la interacción directa con el anillo de cohesina o facilitando transiciones en las cadenas de ADN recién sintetizadas. No obstante, los mecanismos moleculares a través de los cuales estos factores asociados al replisoma promueven el establecimiento de la cohesión siguen sin estar completamente comprendidos. En este estudio, nuestro objetivo es profundizar en la comprensión del establecimiento de la cohesión durante la replicación, analizando la interacción de la cohesina con las cromátidas hermanas de manera específica para cada hebra. Planeamos utilizar la técnica eSPAN (enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA) en levadura de gemación. Esta técnica permite un análisis específico de cadena (leading o lagging) de la unión de proteínas al ADN recién sintetizado. Se plantea estudiar la dinámica de la asociación de la cohesina a los dúplex nacientes en contextos deficientes en factores de establecimiento de cohesión asociados al replisoma, y así obtener información sobre sus funciones moleculares en el atrapamiento de las cromátidas hermanas. Nuestros resultados preliminares evidencian un enriquecimiento de cohesina en sitios de replicación activa y una asociación equivalente de complejos de cohesina a los dúplex nacientes de las hebras leading y lagging, validando así el uso de eSPAN como una herramienta útil para estudiar la dinámica de la cohesina de manera específica y en su interacción con las horquillas de replicación.