Unravelling diversity generating retroelement biases for directed evolution applications

L'ingénierie des protéines visant à obtenir des fonctionnalités améliorées ou nouvelles constitue un domaine de recherche essentiel, aux implications majeures en médecine, biotechnologie, agriculture, sciences de l'environnement et au-delà. Au cours des dernières décennies, une multitude de stratégies ont été mises au point pour atteindre cet objectif, parmi lesquelles l'évolution dirigée reste largement employée. L'évolution dirigée accélère le processus darwinien d'évolution, généralement au travers de cycles itératifs de diversification suivis d'un criblage ou d'une sélection. Un critère principal pour le succès de telles campagnes est l'utilisation d'un système d'hypermutation à la fois très efficace et limité au gène d'intérêt, afin de minimiser les altérations délétères en dehors du gène cible. La nature offre une solution à ce problème : les rétroéléments générateurs de diversité (DGRs). Les DGRs exploitent une transcriptase inverse (RT) intrinsèquement sujette à l'erreur, qui introduit des mutations dans des fenêtres de séquence définies, spécifiquement sur les adénines. Malgré leur potentiel biotechnologique évident, plus de deux décennies après leur découverte, les DGRs n'ont pas encore été déployés avec succès dans des organismes modèles génétiquement manipulables pour l'ingénierie des protéines. Pour combler cette lacune, nous avons développé DGRec, une méthode qui fusionne les composants essentiels de la mutagenèse médiée par les DGRs avec des protéines d'appariement d'ADN simple brin dérivées des technologies de recombineering. En exploitant la forte capacité mutagène de la transcriptase inverse des DGRs, DGRec peut introduire des substitutions dans n'importe quelle région cible de 50 à 200 pb, à des taux atteignant 1,38 × 10⁻² mutations par base et par génération. Le séquençage profond de bibliothèques générées par DGRec a révélé des caractéristiques jusqu'alors inconnues de la biologie des DGRs, notamment des biais de séquence intrinsèques de la RT lors de la diversification. En parallèle, nous avons utilisé des prédictions d'énergie de structures secondaires d'ARN pour anticiper l'efficacité mutagène de cibles spécifiques de DGRec. Afin de d'accélérer davantage le cycle concevoir-construire-tester, nous avons intégré un modèle d'apprentissage profond de type mémoire à long court-terme (LSTM), capable de prédire directement les profils de mutation à partir des séquences dgrRNA. Ce modèle a fidèlement reproduit les schémas de mutagenèse expérimentaux. Le couplage du modèle LSTM à un modèle d'évaluation des protéines a permis une exploration rapide de l'espace combinatoire des séquences. À titre de preuve de concept, nous avons appliqué ce pipeline combiné à Cas9, dans le but de découvrir de nouveaux variants capables de reconnaître des « protospacer adjacent motifs » (PAMs) non canoniques. Dans l'ensemble, DGRec constitue une plateforme polyvalente et à haut débit pour l'hypermutation ciblée, et, associé à la conception assistée par apprentissage automatique, ouvre de nouvelles perspectives pour l'évolution rapide de protéines aux propriétés sur mesure.