Marqueurs de protéines non-covalents réversiblement photoswitchables pour observations multiplexées en imagerie de fluorescence

Les protéines fluorescentes réversiblement photocommutables ont trouvé de multiples applications en bio-imagerie de fluorescence. Dans cette thèse, nous présentons les premiers représentants des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables non-covalentes (ncRSFP), étudions leur comportement dynamique sous illumination et les évaluons pour l'imagerie de fluorescence d'échantillons biologiques. Les ncRSFP ont été conçues en combinant de nouveaux fluorogènes photoisomérisables optimisés pour se lier à des étiquettes protéiques chémogénétiques de la famille FAST. Nous réalisons d'abord une caractérisation thermo-cinétique, photochimique et structurale approfondie du cycle photochimique des ncRSFP en utilisant des techniques de fluorimétrie résolue dans le temps, de spectrométrie UV-visible et de spectroscopie RMN. Cela a nécessité le développement d'un nouveau photoréacteur adapté à l'illumination homogène RMN in situ. Guidés par une analyse théorique detaillée du cycle photochimique, nous identifions un régime cinétique de photoéjection favorable, dans lequel les échanges entre les états liés et libres sont plus lents que les photoisomérisations du fluorogène dans les états liés et libres. Nous démontrons que les ncRSFP se comportent comme un marqueur fluorescent ou comme un marqueur photo-commutatable réversible négatif simplement en ajustant la concentration du fluorogène. Nous exploitons la photoéjection pour montrer que les ncRSFP sont des marqueurs fluorescent efficaces pour le contraste dynamique et la microscopie super-résolue d'échantillons vivants. Après avoir élargi la gamme de fluorogènes et de mutants FAST utilisés dans les ncRSFP, nous avons conclu que la photoéjection est quasi-universelle dans le système FAST. Nous démontrons la photoéjection in vivo de ncRSFP couvrant la gamme spectrale de fluorescence visible-PIR. Allant plus loin, nous transformons les ncRSFP en marqueurs photo-commutables réversibles positifs ou à changement de couleur en exploitant la photocompétition entre deux fluorogènes. Enfin, nous montrons que la photocompétition des ncRSFP peut être utilisée pour la discrimination des mutants FAST dans l'imagerie par fluorescence multiplexée d'échantillons vivants.