Towards single cell and single molecule epitranscriptomics

Les modificacions de l’ARN són una característica important de la regulació i funció gènica posttranscripcional. Tenen implicacions essencials en tots els aspectes de la vida d’una molècula d’ARN i són imprescindibles per al desenvolupament de teràpies basades en ARN. Recentment, la seqüenciació directa de l’ARN s’ha consolidat com un mètode potent per a l’anàlisi de les modificacions de l’ARN a escala transcriptòmica, gràcies a la seva capacitat de detectar simultàniament múltiples modificacions en molècules d’ARN nadiu. No obstant, els protocols actuals de seqüenciació directa d’ARN es limiten a l’anàlisi massiva de milers de cèl·lules, ometent informació sobre la possible heterogeneïtat entre cèl·lules. En primer lloc, en aquesta tesi millorem la detecció de modificacions amb la seqüenciació directa d’ARN i realitzem un ampli exercici de comparació d’aquests mètodes per assegurar-ne la seva robustesa. A continuació, apliquem els nostres coneixements per dur a terme prediccions per posició i per lectura de modificacions químiques presents en teràpies basades en ARN, obrint així possibilitats molt interessants per millorar la selecció d’aquestes molècules. Tot seguit, abordem la seqüenciació directa d’ARN a nivell de cèl·lula única i desenvolupem un algoritme capaç de desmultiplexar 96 mostres amb una alta especificitat i sensibilitat. Finalment, ampliem encara més aquesta idea i desenvolupem un flux de treball de seqüenciació directa d’ARN capaç de seqüenciar l’ARN ribosòmic a partir de tan sols 20.000 cèl·lules i demostrem la capacitat de desmultiplexar-les, in silico, amb elevada especificitat i sensibilitat.