Alkaline pH-inducible synthetic promoters: novel tools for heterologous protein expression in Saccharomyces cerevisiae

La capacitat dels promotors de llevat per respondre als canvis ambientals ha estat aprofitada en el passat per dirigir l'expressió de proteïnes heteròlogues. Alguns exemples inclouen el promotor CUP1, induïble per nivells moderades de coure; el MET25, actiu en condicions de limitació de metionina; o els promotors HSP12 i HSP26, que responen a l’estrès per alta temperatura i àcid acètic. Tanmateix, tot i que útils, els promotors naturals presenten limitacions quan s’utilitzen en entorns de producció industrial. Això ha motivat el desenvolupament de promotors sintètics basats en la combinació d’elements reguladors de la transcripció. En resposta a una alcalinització moderada, Saccharomyces cerevisiae desencadena una àmplia resposta transcripcional que està mediada per diverses vies de senyalització, incloent les vies calcineurina-Crz1, Snf1, Rim101 i PHO. L’alcalinització provoca una pujada gairebé immediata del Ca2+ intracel·lular que activa la fosfatasa calcineurina, la qual desfosforila el factor de transcripció Crz1, permetent la seva entrada al nucli i la seva unió ràpida a les seqüències CDRE (Calcineurin Dependent Response Element). De forma similar, l’alcalinització activa una resposta semblant a la que s’observa en condicions de manca de fosfat, provocant la translocació del factor de transcripció Pho4 al nucli, on s’uneix als elements PHO dels promotors diana, induint la transcripció. Aquestes vies de senyalització regulen l’expressió de gens implicats en l’adaptació a l’estrès, permetent a l’organisme sobreviure en condicions d’estrès alcalí. Un gen clau en aquesta resposta és ENA1, que codifica una Na⁺-ATPasa responsable de la desintoxicació de Na⁺ i Li⁺ en condicions de pH alcalí. Amb l’objectiu de construir promotors sintètics híbrids sensibles a pH alcalí, vam dissenyar construccions que contenien elements CDRE (Crz1) i PHO (Pho4) clonats upstream del promotor basal CYC1, i vam observar que eren capaços d’induir l’expressió del gen reporter yeGFP en condicions alcalines. En avaluar seqüències reguladores addicionals del promotor de ENA1 per modular l’activitat basal, vam descobrir inesperadament que un fragment d’ADN que contenia un lloc repressor Mig1/2 augmentava fortament l’expressió. Aportem evidències que aquesta regió també conté un lloc funcional d’unió pels factors de transcripció Stp1/2 (nt –553 a –544), el quals son activats per la via de detecció d’aminoàcids SPS. Aquest lloc contribueix a la inducció d’ENA1 tant pel pH alcalí com per senyals relacionades amb la disponibilitat d’aminoàcids. A més, l’expressió des d’altres promotors alcalí-induïbles com HXT2, TRX2 i SIT1 també es va reduir en un fons mutat stp1Δ stp2Δ, suggerint un paper més ampli de la via SPS en l’adaptació a condicions alcalines. A partir d’aquests resultats, hem dissenyat biblioteques aleatòries amb múltiples combinacions d’elements CDRE (Crz1) i PHO (Pho4), i hem demostrat que poden dirigir una expressió forta de GFP simplement afegint KOH al medi. L’expressió en soques deficients per Crz1 o Pho4 ens ha permès definir la contribució relativa de cadascun d’aquests elements. També hem demostrat que l’addició d’un fragment de 60 bp del promotor d’ENA1, que conté el lloc d’unió funcional de Stp1/2, millora encara més l’expressió d’alguns dels constructes mes efectius. Finalment, mostrem que aquests constructes poden dirigir una producció elevada de lacasa secretable—un enzim d’interès industrial—amb nivells d’expressió modulables segons el pH. En resum, el nostre treball presenta un nou sistema d’expressió, la inducció de la qual és senzilla, econòmica i fàcil de controlar, i que podria ser una alternativa atractiva als sistemes actuals tant per a aplicacions en recerca com en producció industrial de proteïnes.