Biophysical and biochemical characterization of RhPDEs of Choanoeca flexa for optogenetic application

Die Proteine CfRhPDE1-4 aus Choanoeca flexa wurden in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und auf lichtabhängige PDE-Aktivität als Homodimere untersucht, was nur CfRhPDE1 aufwies. Seine Rhodopsindomäne wurde in Pichia pastoris exprimiert und tag-aufgereinigt. Es wurde ein Absorptionsmaximum bei 492 nm im Dunkeln und ein lichtadaptiertes Photoprodukt bei 390 nm detektiert, welches thermisch mit t = 3,4 s zurückkehrte. Flash-Photolyse wies einen Photozyklus mit kurzlebigem K-Intermediat (t = 134 ns), K/L-like Intermediat (t = 899 µs) und M-state (t = 3,4 s) nach. Die Rekonversion war temperaturabhängig (Ea = 57,3 kJ/mol) und langsamer bei hohem pH, was einen CfRh1 Photozyklus mit deprotoniertem M-state nahelegt. Fluoreszenz-markiertes CfRhPDE1 wurde in aufgereinigten Membranfraktionen aus X.laevis Oozyten, ND7/23 Zellen und HEK293T Zellen charakterisiert. In ND7/23 Membranen verringerte Belichtung den cGMP Km von 4,4 µM auf 1,9 µM und erhöhte den kcat von 2,0 /s auf 4,7 /s. CfRhPDE1 wies eine 500-fach erhöhte Selektivität für cGMP gegenüber cAMP auf. Km und kcat hingen vom Expressionssystem ab. CfRhPDE1 wurde mit einer mutierten Rhodopsin-Guanylylzyklase mit verschobenem Aktionsspektrum kombiniert, was zweifarbige, bidirektionale optogenetische Kontrolle von CNG-Kanälen auf einer Subsekunden-Zeitskala ermöglichte. Dies widerlegt frühere Annahmen verzögerter funktioneller Kopplung in RhPDEs und zeigt, dass RhPDEs optische Stimuli schnell umsetzen können. Ein hochaffiner, rauscharmer CNG-Kanal erwies sich am besten für stufenartiges Photoswitching und die Untersuchung der RhPDE Kinetik. Nach Entfernung des zytosolischen N-Terminus blieb eine Rest-Lichtschaltbarkeit von CfRhPDE1 erhalten. Volllängen-CfRhPDE1 wurde in P.pastoris exprimiert und aufgereinigt. Analytische SEC zeigte eine Reihe verschiedener Spezies mit unbekanntem Oligomerzustand und geringer Ausbeute. Chromatographie und crosslinking/western blotting legen eine dimere PDE-Domäne und dimeres CfRhPDE1 nahe.