Structural insights into the photoactivation mechanism of the orange carotenoid protein

Les cyanobactéries ont considérablement contribué à l’émergence de la vie telle que nous la connaissons sur la planète. Ce succès est largement attribué à leur capacité à s'adapter à des conditions environnementales changeantes, notamment en termes d'irradiation solaire. Dans ce contexte, leur capacité à réguler la photosynthèse est centrale. Les antennes de captation de la lumière que sont les phycobilisomes (PBS) utilisent une large gamme de pigments pour canaliser l’énergie absorbée vers les centres réactionnels des photosystèmes. Cela étant, quand l’irradiation solaire est trop intense, la surexcitation des pigments du PBS peut bloquer la cascade de transfert, menant à l’apparition d’états triplets qui, s’ils ne sont pas neutralisés, finiront par générer de l’oxygène singulet menaçant ainsi la survie cellulaire. C’est dans ce contexte qu’intervient la protéine caroténoïde orange, ou OCP, dont le rôle est de réguler le flux d’excitation arrivant au cœur du phycobilisome. Du point de vue structural, l’OCP se présente comme une protéine à deux domaines N- et C- terminaux (NTD et CTD, respectivement), enchâssant un kéto-caroténoïde à leur interface. En présence de lumière bleue-verte intense, la forme de la protéine adaptée à l’obscurité évolue vers une forme adaptée à la lumière, métastable mais seule capable de se lier au PBS, dissipant alors l'excès d'excitation sous forme de chaleur.Le mécanisme qui sous-tend la transition entre les deux états reste élusif et activement débattu, cependant il est généralement admis qu’en suite de l’absorption du photon bleu-vert, le caroténoïde passe à l’état excité S2, à partir duquel trois chemins de relaxation existent, dont un seul est compatible avec la progression vers l’état activé de la protéine. Nécessiteront d’être rompues sur ce chemin réactionnel les deux liaisons hydrogènes ancrant le caroténoïde au CTD, autorisant ainsi sa translocation dans le NTD et la dissociation des deux domaines, qui exposera l’épitope du PBS. Las, le rendement quantique de la protéine est extrêmement faible après excitation par un photon unique, ce qui a jusqu’ici grandement compliqué l’étude du mécanisme de photoactivation par des méthodes structurales. Récemment, il a été proposé que la photoactivation efficace de l’OCP repose sur un mécanisme à deux photons, lequel serait applicable ou non, selon le pigment considéré.Au cours de cette thèse, nous avons utilisé une variété de méthodes biophysiques, biochimiques et structurales en vue de lever le voile sur le mécanisme de photoactivation de l’OCP. Notamment, nous avons montré par cristallographie à température ambiante que l’état 1-photon de la protéine, jusqu’ici caractérisé uniquement par spectroscopie, pouvait être piégé et accumulé dans les cristaux. Nous avons vérifié la relevance de cet état par mutagénèse, fluorimétrie résolue en température, ainsi que par spectroscopie d’absorption transiente ou d’équilibre. Les spécificités inhérentes à la fonctionnalisation par différents cofacteurs ont également été étudiées, permettant de démontrer la généralité du mécanisme à deux photons. Finalement, les changements structuraux associés à la photo-excitation des états adapté à l’obscurité et 1-photon ont été caractérisés, à l‘échelle atomique et sur une gamme de temps allant du centième de picoseconde à la dizaine de millisecondes. Les résultats obtenus par cette approche multi-technique offrent une vision plus claire du mécanisme de photoactivation, illustrant notamment comment des états extrêmement transients peuvent être stabilisés sur plusieurs décades de temps par des changements structuraux précis dans l'architecture de la protéine. Ce travail répond ainsi à de multiples questions restées longtemps sans réponse concernant la photoactivation de l’OCP, ouvrant la voie vers la conception rationnelle de variants adaptés à l’optogénétique ainsi qu’à la régulation des systèmes photosynthétiques artificiels bio-inspirés.