Evolution dirigée pour la protéomique des nouvelles générations.

Tout comme le séquençage de nouvelle génération (NGS) de l’ADN a ouvert une nouvelle ère dans la compréhension de l’hérédité et de la régulation génétique, le séquençage de nouvelle génération des protéines (NGPS) promet d’être une avancée majeure de la protéomique, en apportant un éclairage nouveau sur la complexité et la dynamique des états cellulaires. Le NGPS permettra d’étudier les modifications post-traductionnelles et les changements du protéome associés aux maladies d’une manière impossible avec le séquençage de l’ADN.Quantum-Si a démontré la faisabilité du séquençage de peptides à molécule unique sur un instrument de paillasse compact (Platinum™), en utilisant une approche de dégradation dynamique par étapes. Dans cette technologie, des centaines de milliers de peptides immobilisés en surface sont sondés, en temps réel et au niveau de la molécule unique, par un mélange de reconnaisseurs N-terminaux marqués par un colorant, tout en étant simultanément clivés par des aminopeptidases. En mesurant l’intensité de fluorescence, la durée de vie et la cinétique de liaison sur une puce à semi-conducteurs, la machine identifie les acides aminés et détermine la séquence peptidique.Pour améliorer les performances du séquençage, nous avons utilisé l’évolution dirigée et l’ingénierie des protéines appliquées à des reconnaisseurs naturels, afin de développer de nouvelles variantes ou d’améliorer celles existantes. J’ai mené plusieurs campagnes d’évolution dirigée et de conception rationnelle, identifiant la validation des résultats issus de sélections à très haut débit comme un goulot d’étranglement. Pour y remédier, j’ai conçu un test de validation rapide, fiable et multiplexé. Trois programmes d’ingénierie ciblant six acides aminés sont présentés. Un reconnaisseur des acides aminés amidiques (glutamine et asparagine) a été reconfiguré pour reconnaître les acides aminés acides (glutamate et aspartate). Nous avons aussi modifié la spécificité d’un reconnaisseur des petites chaînes latérales (glycine, alanine, sérine) pour reconnaître des chaînes légèrement plus volumineuses (valine et thréonine) grâce à la conception rationnelle. Enfin, nous avons amélioré l’affinité et la cinétique de liaison d’un reconnaisseur naturel de l’arginine, ce qui a permis d’étendre sa couverture et d’inclure la reconnaissance de l’histidine dans la technologie NGPS.Pour évaluer des variants sur leurs propriétés cinétiques plutôt que leur seule affinité, j’ai développé un test sur puce basé sur le codage à barres peptidique et des mesures au niveau de la molécule unique sur le Platinum™. Ce test permet d’analyser, en parallèle, les paramètres cinétiques de liaison. Nous avons utilisé cette approche pour étudier l’effet combinatoire de mutations issues d’un cycle d’évolution sur un reconnaisseur de l’arginine. J’ai également développé un modèle d’apprentissage automatique basé sur les interactions déduites de données structurales et sur un modèle cinétique expérimental issu de véritables expériences NGPS. Les prédictions corrélaient avec le modèle expérimental et avec les données issues du test de validation.Enfin, nous montrons comment un modèle de Restricted Boltzmann Machine, entraîné par nos collaborateurs sur des alignements de domaines WW naturels, peut être utilisé pour concevoir des séquences artificielles et prédire des trajectoires évolutives entre domaines WW de spécificités différentes. Ces trajectoires ont été validées expérimentalement à l’aide du test de validation à haut débit, en évaluant la liaison à trois peptides de classes distinctes. Fait intéressant, les formes sauvages ont montré des réponses différenciées lors du test.