Redox‐aktivierte Sonden für Hochkontrastige Live‐Bildgebung Postsynaptischer Neuronaler Gerüste

ZUSAMMENFASSUNG Die direkte Visualisierung postsynaptischer Gerüstproteine in lebenden Neuronen ist eine entscheidende Voraussetzung für die Untersuchung synaptischer Dynamik und Plastizität. Bisherige Methoden zur Live‐Synapsenbildgebung sind jedoch stark eingeschränkt: Sie erfordern genetische Manipulationen oder beruhen auf mehrstufigen Protokollen mit für Live‐Cell Imaging ungeeigneten Antikörpern bzw. Nanobodies. Zudem liefern verfügbare Affinitätssonden und Strategien zur intrazellulären Markierung oft nicht den erforderlichen Kontrast, etwa durch unvollständige zytosolische Abgabe oder überschüssige Sonde mit Hintergrundsignal. Hier stellen wir Sylives vor, eine Familie kompakter, synthetischer fluoreszenter Peptide zur kontrastreichen Live‐Bildgebung inhibitorischer (Gephyrin) und exzitatorischer (PSD‐95) postsynaptischer Gerüstproteine in primären Neuronen. Durch Vorreinigung des redoxspaltbaren Konjugats aus zellpenetrierendem Peptid und Sonde vermeiden wir Nebenprodukte der in‐situ‐Kopplung und erzielen eine reproduzierbare zytosolische Aufnahme mit nach intrazellulärer Reduktion vollständig wiederhergestellter Bindung an das Zielprotein. Die funktionelle Entkopplung von Zellaufnahme und Zielproteinadressierung ermöglicht saubere Markierung bei nanomolaren Sondenkonzentrationen, während die Aufnahme durch mikromolare Konzentrationen zellpenetrierender Peptide gewährleistet wird. Quantitative Experimente identifizieren die entscheidenden Assay‐Parameter und die optimalen Bedingungen für eine effiziente zytosolische Aufnahme der Sonden. Spezifität und nahezu rückstandsfreie Aufnahme belegen wir durch den direkten Vergleich mit transient exprimierten Proteinen sowie durch Immunfärbungen in fixierten Neuronen. Sylives ermöglichen damit eine kontrastreiche Markierung endogener postsynaptischer Strukturen ohne genetische Modifikation und bieten eine modulare Plattform zur Adressierung weiterer intrazellulärer Zielproteine in lebenden primären Neuronen.