Exploring the potential of EVs as biological mRNA delivery systems

Les vesícules extracel·lulars (VEs) són cada cop més reconegudes pel seu potencial com a sistemes naturals de lliurament de fàrmacs o gens en aplicacions terapèutiques. No obstant, els avenços en la seva manipulació, aïllament i caracterització no han evolucionat en paral·lel amb aquest interès. La manca de protocols estandarditzats per a l’aïllament i caracterització de les VEs afecta tant a la qualitat com la producció de VEs, comprometen la fiabilitat experimental. A més, la recerca sobre condicions òptimes d'emmagatzematge és limitada, la qual cosa és essencial per mantenir l'estabilitat de les VEs i possibilitar la seva aplicació clínica. La càrrega eficient de material genètic continua sent un desafiament, amb poques investigacions sobre tècniques efectives, mentre que la informació confusa en la literatura impedeix encara més el seu progrés. Abordar aquestes llacunes és fonamental per desbloquejar el potencial clínic de les VEs com a sistemes d’alliberament terapèutics. Aquesta tesi té com a objectiu avançar en el camp de la recerca de les VEs abordant limitacions clau en la seva caracterització, emmagatzematge i aplicació funcional com a sistemes naturals de lliurament de gens. Mitjançant la implementació d'un conjunt de tècniques complementàries per a la caracterització biofísica i bioquímica de les VEs, s'estableix una plataforma de caracterització robusta dins la nostra institució. Per afrontar el repte de l'emmagatzematge de VEs, es desenvolupa un nou mètode de liofilització, amb l'objectiu de preservar les característiques biofísiques i bioquímiques de les VEs al llarg del temps. Les VEs liofilitzades conserven la seva distribució de mida, morfologia, puresa i funcionalitat, reforçant així el seu potencial com a producte clínic “llest per utilitzar”. Finalment, aquesta tesi explora la càrrega exògena de mRNA en VEs, un pas clau per crear un sistema de lliurament basat en ARN eficient. Es comparen cinc mètodes comuns de càrrega de mRNA, destacant el congelació-descongelació com el més efectiu. Les discrepàncies en l'eficiència de càrrega i lliurament entre els mètodes s'haurien d'estudiar més a fons per millorar la funcionalitat de les VEs. Tot i així, la proporció de VEs carregades aconseguida amb aquests mètodes proporciona una base prometedora per al desenvolupament continu. En resum, aquesta tesi estableix metodologies essencials per a la investigació de VEs, incloent tècniques rigoroses de caracterització, un protocol d’emmagatzematge adequat i una estratègia de càrrega de mRNA efectiva. Aquests avenços pretenen contribuir a apropar les VEs a futures aplicacions clíniques.