Development of advanced techniques to elucidate the intracellular trafficking of pßAE nanoparticles

Comprendre el comportament complex de les nanopartícules (NPs) dins dels sistemes biològics és essencial per avançar en el camp de la nanomedicina. Tanmateix, la visualització de la dinàmica de les NPs continua sent un repte considerable a causa de les limitacions actuals en les tècniques d'imatge. Aquesta tesi aborda aquesta bretxa desenvolupant i perfeccionant mètodes avançats de microscòpia per obtenir una profunda comprensió del comportament de les NPs, ampliant així les fronteres de la investigació de nanoformulacions per a aplicacions biomèdiques. Per establir una base per a aquests estudis, ens vam centrar en la caracterització de les nostres nanopartícules de OM-pBAE (Oligo Modified poly(β-amino ester)), polímers biodegradables i biocompatibles. Mitjançant la modificació sistemàtica dels grups oligopeptídics terminals, vam investigar com aquestes alteracions impactaven les propietats fisicoquímiques i mecàniques, així com les seves interaccions dins dels entorns cel·lulars. Amb diverses tècniques de caracterització, vam avaluar els efectes de cada modificació en l’estabilitat de les NPs, la internal·lització cel·lular i l'eficiència de transfecció, identificant diferències substancials en el trànsit intracel·lular segons les diferents NPs utilitzades. Aquests estudis van posar de manifest una limitació important: les tècniques d'imatge convencionals eren insuficients per desxifrar completament les rutes intracel·lulars i el destí d’aquestes nanopartícules. Per superar aquest repte, metodologies innovadores han estat desenvolupades, com la Polyplex Expansion Microscopy (PExM) i Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM), que ofereixen una super -resolució per a poder estudiar el trànsit i la localització de les NPs. Aquests mètodes van revelar com variacions estructurals subtils entre les nanopartícules influeixen en les seves rutes intracel·lulars, destacant especialment el paper de la histidina en la facilitació de l’alliberament endosomal. Aquest pas crític per a una distribució eficient implica la desestabilització de les membranes endosomals induïda per la histidina, permetent que les NPs arribin a alliberar el seu principi actiu dins de les cèl·lules. A partir d'aquests resultats, vam investigar el comportament de les NPs de OM-pßAE en models cel·lulars 3D, avançant més enllà dels cultius tradicionals en 2D per simular millor les condicions in vivo. Utilitzant la Multiphoton Microscopy (MPM), vam visualitzar la penetració i distribució de les NPs de OM-pBAE en esferoides, obtenint informació valuosa sobre com aquestes NPs naveguen per estructures biològiques complexes. Els resultats van demostrar que les NPs que contenien histidina presentaven una major penetració i distribució intracel·lular, en línia amb els resultats obtinguts en estudis amb cultius cel·lulars en 2D. Col·lectivament, aquesta tesi no només subratlla la necessitat de comprendre en profunditat el comportament dels nanosistemes en entorns específics per millorar l'eficàcia clínica, sinó que també contribueix amb eines noves i potents per a la comunitat de recerca en nanomedicina. Aquests avenços permeten estudis més precisos dels sistemes de distribució de fàrmacs (DDS) i obren el camí per al disseny i aplicació optimitzats de teràpies basades en nanopartícules.