Reconstitution in vitro du transport de lipides par la flippase Drs2-Cdc50

Dans les membranes eucaryotes des voies sécrétoires et endocytaires tardives, les phospholipides anioniques comme la phosphatidylsérine (PS) ou le phosphatidylinositol (PI) sont localisés quasi exclusivement sur le feuillet cytosolique, organisation essentielle au trafic vésiculaire et à la signalisation cellulaire. Les ATPases-P4 (flippases) maintiennent cette asymétrie transverse en transportant activement les lipides du feuillet exoplasmique vers le feuillet cytosolique. Leur importance est illustrée par le lien entre des mutations de l'ATPase-P4 humaine ATP8B1 et une maladie hépatique sévère, soulignant le rôle critique de l'asymétrie lipidique. Malgré les avancées structurales, les mécanismes reliant leur dysfonctionnement aux pathologies restent mal compris, notamment en raison des difficultés à étudier leur activité de transport in vitro et sa régulation.Au cours de ma thèse, j'ai étudié la flippase de levure Drs2, homologue d'ATP8B1, comme système modèle. Drs2 transporte la PS au niveau du trans-Golgi (TGN) et forme un complexe étroit avec la sous-unité Cdc50. Son activité requiert le phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) et est autoinhibée par ses longues extensions N- et C-terminales. Drs2 interagit avec la petite GTPase Arl1 et le facteur d'échange de nucléotides de Arf1, Gea2, qui coopèrent également entre eux dans le trafic du TGN. La délétion de Arl1 ou de Gea2 perturbe le transport de la PS, mais leurs mécanismes d'interaction avec Drs2 restent à élucider. Nous posons l'hypothèse qu'in vivo, la liaison d'Arl1 et Gea2 aux extrémités N- et C-terminales soulève l'autoinhibition de Drs2.Les objectifs de cette thèse sont triples. Premièrement, établir un protocole robuste de reconstitution permettant de démontrer le transport lipidique par Drs2 in vitro. Deuxièmement, utiliser ce système pour réévaluer la spécificité lipidique de Drs2. Bien que la PS ait longtemps été considérée comme son substrat principal, certaines données suggéraient que d'autres phospholipides pouvaient être transportés. Après purification du complexe Drs2/Cdc50, nous avons observé que son activité ATPasique en détergent était stimulée non seulement par la PS, mais aussi par d'autres lipides anioniques : PI, phosphatidylglycérol (PG) et acide phosphatidique (PA). En revanche, les lipides zwitterioniques phosphatidyléthanolamine (PE) et phosphatidylcholine (PC) ne sont pas des substrats. Pour mesurer directement la translocation, nous avons reconstitué Drs2/Cdc50 avec du PI4P et des phospholipides fluorescents dans des liposomes contenant de la PC. Un test de transport basé sur la fluorescence a montré que Drs2 catalyse activement le transport de NBD-PS, -PI, -PG et -PA, confirmant une spécificité plus large que prévue. Des structures cryo-EM de Drs2/Cdc50 ont corroboré ces données en révélant l'occlusion de PS, PG et PI dans le site de fixation du substrat.Ces résultats démontrent que Drs2/Cdc50 reconnaît divers lipides anioniques, notamment le PI, suggérant un rôle des ATPases-P4 dans le renouvellement de lipides de signalisation et mettant en évidence un impact plus large sur la signalisation intracellulaire et la dynamique membranaire.Enfin, le troisième objectif est de reconstituer le complexe complet Drs2/Cdc50 en présence de ses régulateurs Arl1 et Gea2 dans des protéoliposomes, afin d'examiner leurs rôles dans l'activation de Drs2 et dans la régulation de la sélectivité des substrats. J'ai ainsi caractérisé in vitro les interactions entre Drs2/Cdc50, Arl1 et Gea2 purifiés par différentes méthodes biophysiques. Ce travail jette les bases de la reconstitution du complexe tripartite complet dans des membranes artificielles, ouvrant la voie à de futures études fonctionnelles et structurales.