Investigating the function of WTAP and METTL3 in the cardiovascular system

In den letzten zehn Jahren hat sich N6-Methyladenosin (m6A) als wichtiger Regulator der Genexpression herauskristallisiert; sein spezifischer Beitrag zur Morphogenese des Herzens ist jedoch nach wie vor nicht vollständig geklärt. m6A wird auf der mRNA durch einen Multiproteinkomplex installiert, welcher METTL3, die katalytisch aktive Komponente des Komplexes, und WTAP umfasst, welches für die korrekte Lokalisierung und Funktion des Komplexes essentiell ist. Um die Rolle von m6A bei der Herzentwicklung zu untersuchen, haben wir Kardiomyozyten-spezifische Knockout-Mäuse für Mettl3 (Mettl3 cKO) und Wtap (Wtap cKO) erzeugt, wobei die Gendeletion am Embryonaltag 7,5 (E7,5) stattfindet, was mit dem Beginn der Kardiomyozytenbildung in der Herzsichel zusammenfällt. Mettl3 cKO-Embryonen entwickelten sich im Mendelschen Verhältnis bis zur Geburt und zeigten keine Anzeichen von embryonalem Herzversagen. Dennoch starben alle Mettl3 cKO- Neugeborenen innerhalb der ersten postnatalen Woche. Die morphologische Analyse ergab fortschreitende ventrikuläre Missbildungen, einschließlich einer reduzierten ventrikulären Länge, einer Verringerung des kompakten Myokards und Anzeichen einer ultrastrukturellen Unreife. Elektrokardiographische Aufzeichnungen von E19,5-Embryonen zeigten schwere elektrophysiologische Defekte in Mettl3 cKO-Herzen, einschließlich verlängerter QT- Intervalle und T-on-P-Wellenformen, die den Merkmalen des Long-QT-Syndroms sehr ähnlich sind. Die RNA-Sequenzierung ergab eine weit verbreitete Dysregulation von Genen, die am Umbau der extrazellulären Matrix, an der Entwicklung des Herzmuskels und am Ionentransport beteiligt sind - insbesondere an Kaliumkanälen, welche für die Repolarisierung entscheidend sind. Weitere Transkriptomanalysen zeigten eine gestörte zeitliche Expression von Genen des kardialen Reizleitungssystems und des arbeitenden Myokards, was auf eine gestörte Spezifikation der Kardiomyozyten-Subtypen in Abwesenheit von Mettl3 hindeutet. In deutlichem Gegensatz dazu führte Wtap cKO zu einem wesentlich schwerwiegenderen Phänotyp. Wtap-defiziente Embryonen wiesen tiefgreifende Defekte bei der Proliferation von Kardiomyozyten und der Herzfunktion auf, die in der embryonalen Letalität um E16,5 gipfelten 17 - wesentlich früher als der perinatale Tod, der bei Mettl3 cKO-Mäusen beobachtet wurde. Die RNA-Sequenzierung von Wtap cKO-Herzen ergab eine starke Herunterregulierung von Zellzyklus- und Sarkomergenen, was eine entscheidende Rolle von WTAP in der frühen Herzentwicklung hervorhebt, die nicht allein durch m6A-Defizite erklärt werden kann. Es ist bekannt, dass WTAP m6A-unabhängige Funktionen ausübt, darunter die Regulierung des RNA-Spleißens und die Stabilisierung von Transkripten durch Bindung an 3′ untranslatierte Regionen (UTRs). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass der schwerere Phänotyp, der bei Wtap-cKO-Mäusen beobachtet wird, wahrscheinlich auf den Verlust dieser zusätzlichen, m6A-unabhängigen Funktionen zurückzuführen ist. Um die Rolle von WTAP in adulten Kardiomyozyten zu untersuchen, haben wir ein Tamoxifen- induzierbares, Kardiomyozyten-spezifisches Wtap-Knockout-Mausmodell (Wtap iKO) verwendet. Nach der Gendeletion entwickelten Wtap iKO-Mäuse eine fortschreitende ventrikuläre Dilatation und eine fatale Verschlechterung der Herzfunktion, die an eine dilatative Kardiomyopathie erinnerte. Shotgun-Proteomik- und individual-nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) Analyse ergaben, dass WTAP mit einer Reihe von Spleißregulatoren interagiert und RNA in H1299-Zellen direkt bindet, was seine m6A- unabhängige Rolle weiter stützt. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass sowohl METTL3 als auch WTAP für die Herzentwicklung essentiell sind, während WTAP zusätzlich eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Herzfunktion im Erwachsenenalter spielt. Die schwerwiegenderen Folgen der Deletion von Wtap im Vergleich zur Deletion von Mettl3 deuten darauf hin, dass die dominante Rolle von WTAP in Kardiomyozyten unabhängig von m6A sein könnte. Dennoch sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die diesen phänotypischen Unterschieden zugrunde liegen