Impact of the NOX3-N64Y mutation on ROS production and structural stability: Implications for cerebellar development

NADPH oxidases são uma família de proteínas transmembrana importantes na regulação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) celular. As NOX formam complexos transmembrana para produzir EROs através da redução do oxigênio, produzindo principalmente superóxido. O camundongo Nox3eqlb possui uma mutação no gene Nox3, resultando em uma substituição de um resíduo de asparagina por uma tirosina na posição 64 (N64Y). Essa mutação causa alterações morfológicas e moleculares no cerebelo, incluindo maior ativação da via de sinalização SHH-GLI. Até o momento, a estrutura da NOX3 não foi estabelecida experimentalmente, assim, o impacto de mutações pontuais na Nox3, por exemplo, da mutação N64Y, e suas consequências na atividade da proteína permanece desconhecido. O entendimento de como uma mutação afeta a estrutura da NOX3 pode permitir o melhor entendimento de sua função. Assim, para entender os efeitos da mutação pontual N64Y na estrutura da proteína NOX3, e os mecanismos celulares pelo qual essa mutação afeta a via de sinalização SHH-GLI, nós utilizamos duas abordagens: uma in sílico, modelando e comparando a estrutura da NOX3 selvagem e de várias mutações pontuais em NOX3, incluindo a NOX3-N64Y, e uma abordagem in vitro para verificar as respostas da sinalização SHH-GLI ao aumento de EROs induzido pela NOX3-N64Y. O modelo NOX3 compartilha características com outras NOXs como o formato piramidal, com base triangular e ápice mais estreito próximo à membrana externa, grupos heme ancorados perpendicularmente à membrana e um túnel intramembrana que facilita a transferência de elétrons. A mutação N64Y ocorre na segunda α-helice transmembrana, entre os dois grupos heme-b. Os modelos preditos e resultados de docking sugerem que as mutações na região α-helice podem interromper a atividade da NOX3 pela desestabilização da transferência de elétrons no túnel intramembrana. Para estudar os mecanismos pelo qual a NOX3 afeta a sinalização SHH-GLI, nós criamos um modelo in vitro para simular a mutação do Nox3eqlb. Nós transfectamos células DAOY com plasmídeos contendo NOX3-N64Y. PCR em tempo real revelou um aumento significativo da expressão de Nox3 em ambos os grupos transfectados com NOX3 e NOX3-N64Y comparados com o grupo controle. Também observamos aumento na produção de superóxido em células transfectadas com NOX3-N64Y. Além disso, a transfecção de NOX3-N64Y resultou na diminuição da expressão de Gli3, que foi revertido com o tratamento com apocinina. Ensaios de Western blotting e imunofluorescência mostram que NOX3 afeta os fatores de transcrição GLI. Os níveis de GLI1 foram reduzidos e GLI3 aumentados em células transfectadas com NOX3. Estes achados indicam que os EROs produzido pela NOX3 é capaz de modular a atividade inibitória da via de SHH-GLI de forma não canônica. Em conclusão, a mutação N64Y afeta a estrutura da proteína NOX3 incapacitando-a e levando a um aumento de EROs. O aumento na produção de EROs afeta a via de sinalização SHH-GLI, possivelmente de forma não canônicaa. Nossos achados realçam a importância de se entender como a incapacitação da atividade da NOX3 pode resultar no aumento dos níveis fisiológicos de EROs afetando processos biológicos como a proliferação celular.