Découverte de nanocorps et approches d'ingénierie de l'affinité pour le ciblage des récepteurs ionotropiques du glutamate

Les récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluRs) sont une famille de canaux ioniques ligandés qui conduit la plupart des neurotransmissions excitatrices dans le système nerveux central. Ils sont classés comme suit: AMPA (GluA1-4), kaïnate (GluK1-5), NMDA (GluN1-3) et delta (GluD1-2) et leurs sous-unités déterminent les propriétés de signalisation. Pour comprendre les mécanismes de transmission excitatrice, il est crucial d'étudier la composition, la localisation et le trafic des iGluRs à la synapse. Mon doctorat vise à découvrir des nanocorps spécifiques d'une sous-unité et de haute affinité en tant qu'outils moléculaires polyvalents pour étudier la nature dynamique de ces récepteurs. Ils seront utilisés pour l'imagerie à super-résolution et pour des études de biologie structurale et de protéomique afin d'élucider les conformations et compositions natives des récepteurs.Pour découvrir de tels liants contre les récepteurs kaïnates (GluK2/K5), j'ai implémenté la procédure de découverte de nanobodies synthétiques (sybody) en utilisant trois banques structurellement distinctes (convexe, concave et boucle) développées à l'Université de Zurich(Zimmermann et al., 2018). Chaque banque est examinée pour trouver des liaisons contre une protéine cible en utilisant un ensemble de techniques de sélection, à savoir l'affichage sur les ribosomes et l'affichage sur les phages(Zimmermann et al., 2020). Les sybodies sélectionnés sont caractérisés sur le plan biophysique et biochimique, mais ils présentent des affinités et des propriétés cinétiques sous-optimales. Nous avons donc opté pour l'approche de l'immunisation du lama pour découvrir des nanocorps contre le récepteur GluK2/K5.Basé sur nos observations précédentes, nous avons opté pour une banque de nanocorps dérivés de l'immunité contre le récepteur NMDA (GluN1/N2b). Nous avons alors opté pour la sélection par affichage de surface sur levure, afin d'effectuer des sélections quantitatives et qualitatives par tri cellulaire activé par fluorescence(Chao et al., 2006). Pour cela, j'ai établi un système d'affichage optimisé en utilisant un vecteur d'affichage de levure conçu en interne et la souche RJY100 (Van Deventer et al., 2015). Cette technique nous a permis d'obtenir un nanocorps contre le récepteur NMDA humain entier GluN1/N2b, qui a été caractérisé pour évaluer ses propriétés de liaison. Le nanocorps obtenu a été identifié comme un candidat modérément fort, nécessitant une ingénierie d'affinité pour améliorer sa force de liaison.Pour cela, on a utilisé une technique d'évolution moléculaire continue appelée AHEAD (Autonomous Hypermutation yEast surface Display)(Wellner et al., 2021). Elle est une plateforme de maturation par affinité in vitro qui introduit des mutations dans une séquence cible directement dans les cellules de levure par une polymérase sujette aux erreurs, permettant une diversification continue et l'affichage en surface des variants pour des sélections ultérieures. En m'appuyant sur les résultats obtenus précédemment dans le laboratoire, j'ai appliqué le système AHEAD à l'interaction de la pentraxine neuronale 1 avec la GluA4. Ce projet a un double objectif; améliorer l'interaction NP1-GluA4 et établir les différents paramètres et conditions requis pour le système AHEAD. La prochaine étape consiste à appliquer cette stratégie pour le nanocorps du récepteur NMDA.Mes travaux décrivent le criblage d'une banque de sybodies, l'exploration du répertoire immunitaire, l'optimisation des stratégies d'affichage et l'ingénierie d'affinité des protéines, créant ainsi une plateforme efficace pour générer des nanocorps. Tous les flux de travail sont compatibles avec une variété d'échafaudages moléculaires; répertoires naturels, synthétiques et informatiques. Mes travaux de doctorat ont plusieurs applications futures de ces outils en microscopie, en biologie structurale, en protéomique et en thérapeutique, contribuant ainsi aux études fonctionnelles et mécanistiques des iGluR.