Caractérisation des systèmes toxine-antitoxine de type I txpA/RatA et hok/Sok : de la régulation à la fonction

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont très répandus dans les génomes bactériens. En raison de leur action bactéricide, ils sont considérés comme des cibles prometteuses pour le développement d'antibiotiques. Dans les systèmes toxine-antitoxine de type I (T1TA), l'antitoxine est un petit ARN qui régule l'expression de l'ARNm de la toxine au niveau post-transcriptionnel, en empêchant sa traduction. D'autres mécanismes de régulation sont aussi présents, définis par la structure secondaire des ARNm des toxines. Ces mécanismes, décrits seulement pour quelques familles de T1TA varient en fonction de la famille de toxines et selon qu'elles sont codées par des bactéries Gram-négatives ou Gram-positives. Les fonctions biologiques des T1TA comprennent le maintien d'éléments génétiques mobiles, la défense contre les phages et la persistance bactérienne. Bien que de nombreuses familles de T1TA aient été décrites, la plupart des études se sont concentrées sur un seul représentant par famille, laissant de ce fait la diversité fonctionnelle d'autres loci au sein de la même famille et leur potentiel toxique largement inexplorés. Ce manuscrit est structuré en quatre chapitres traitant des mécanismes de régulation de la traduction de deux T1TA : txpA/RatA de Bacillus subtilis et hok/Sok d'Escherichia coli (chapitres 1 et 2), de l'activité toxique des homologues de hok/Sok (chapitre 3) et du rôle du système hok/Sok dans la médiation de la défense contre les phages (chapitre 4).Dans le premier chapitre, nous avons cherché à identifier les mutations de perte de fonction au sein de l'ARNm de txpA en utilisant une approche génétique indirecte reposant sur une caractérisation phénotypique, suivie d'un séquençage haut débit, une méthode appelée FASTBAC-Seq. Cependant, il n'a pas été possible de générer suffisamment de transformants pour le séquençage haut débit. Néanmoins, le projet a été réorienté vers l'étude de l'expression de l'ARNm de txpA dans E. coli où nous avons montré que, contrairement à ce qui avait été décrit précédemment, la toxine TxpA était létale pour E. coli et que son expression était régulée par sa région 5′ non traduite (UTR).Dans le second chapitre, nous avons cherché à identifier des mutants LoF qui impactent la traduction de hok. En particulier, notre objectif était de générer des souches individuelles présentant des substitutions uniques de perte de fonction en vue d'une caractérisation plus poussée, suivie d'une identification complète de toutes les substitutions possibles qui affectent l’expression de hok. Nous avons pu construire 44 mutants de perte de fonctions, et identifier 112 mutations dans la région 5′ UTR qui empêchent la traduction de Hok. Cependant, leur mode d'action n'a pas pu être élucidé sur la base des connaissances actuelles, ce qui souligne la présence de mécanismes de régulation non caractérisés régissant l'expression de Hok.Dans le troisième chapitre, nous avons testé la toxicité des homologues de Hok. Nous avons sélectionné 35 homologues de Hok avec des séquences diverses et nous avons testé leur toxicité dans Salmonella Typhimurium après induction de la surexpression via un promoteur inductible. Les séquences codante de Hok entrent dans deux catégories : toxique and non-toxique, indépendamment de la conservation de leur séquence ou de leur localisation (chromosome ou éléments génétiques mobiles).Enfin dans le quatrième chapitre, nous avons cherché à comprendre les détails du mécanisme de défense contre les bacteriophages par le système hok/Sok. Nous avons suivi la densité optique à 600 nm d’E. coli hébergeant un vecteur hok/Sok lors de l'infection par le phage T4. Contrairement à une étude ultérieure, nous n’avons pas observé de protection conférée par le système hok/Sok system contre le phage T4 dans nos conditions expérimentales.Dans l'ensemble, ces résultats offrent de nouvelles perspectives sur la régulation de la traduction, l'activité et la fonction des T1TA.