Spike-in enhanced phosphoproteomics uncovers synergistic signaling responses to MEK inhibition in colorectal cancer cells

Kolorektaler Krebs (CRC) gehört zu den häufigsten krebsbedingten Todesursachen und wird häufig durch eine dauerhafte Aktivierung der RAS-RAF-MEK-ERK-Signalkaskade angetrieben. MEK-Inhibitoren zeigen in CRC jedoch nur begrenzte Wirksamkeit, da negative Rückkopplungsschleifen aufgehoben werden und kompensatorische Signalwege wie PI3K/AKT oder alternative MAPK-Kaskaden die Proliferation aufrechterhalten. Viele regulatorisch zentrale, aber niedrig abundant vorkommende Phosphorylierungsereignisse bleiben in Standard-Phosphoproteomik unerfasst. Diese Arbeit etabliert Spike-In Enhanced Detection in DIA (SPIED-DIA), einen Workflow, der synthetische Referenzphosphopeptide in DIA-Messungen einbettet, um vordefinierte Phosphosites gezielt und gleichzeitig im Kontext globaler Phosphoproteomik zu erfassen. Benchmark-Experimente zeigen, dass SPIED-DIA die Nachweiswahrscheinlichkeit und Quantifizierbarkeit kritischer Signalknoten erhöht und zuverlässiger zwischen „niedrig abundant“ und „nicht vorhanden“ unterscheidet, ohne die Breite ungezielter DIA-Analysen einzubüßen. Die Anwendung von SPIED-DIA auf CRC-Zelllinien unter MEK-Hemmung und Wachstumsfaktorstimulation identifiziert eine synergistische Aktivierung von PI3K/AKT und eine starke, behandlungsabhängige Aktivierung von JNK, insbesondere in KRAS-mutierten HCT116-Zellen. Globale Phosphoproteomik bestätigt diese Muster und offenbart zelllinienspezifische Fluchtstrategien. Funktionelle Assays zeigen, dass die kombinierte Hemmung von MEK und PI3K bzw. MEK und JNK das Zellwachstum synergistisch unterdrücken kann. Insgesamt liefert die Arbeit sowohl einen methodischen Beitrag zur sensitiven, zielgerichteten Phosphoproteomik als auch einen mechanistischen Einblick in JNK-vermittelte Resistenzmechanismen gegenüber MEK-Inhibition in CRC.