Evaluating phosphopeptides quantification across various acquisition methods and bioinformatic tools : novel standards and their utility in algorithm development

La phosphoprotéomique vise à identifier, localiser et quantifier les phosphopeptides dans des échantillons protéiques complexes, dans le but de fournir des informations essentielles sur la signalisation cellulaire. Cependant, malgré des avancées analytiques significatives, des défis persistent en matière d'identification, de localisation et de quantification des phosphopeptides. Bien que de nombreuses études aient évalué les performances des algorithmes de localisation des sites de phosphorylation, l'impact des erreurs de localisation sur la précision de la quantification dans les approches sans marquage a été peu exploré. Dans ce contexte, ce projet de thèse vise à évaluer différents aspects de l'analyse phosphoprotéomique sans marquage à travers plusieurs instruments de spectrométrie de masse (un Thermo Exploris 480, avec ou sans séparation ionique FAIMS, et un Bruker timsTOF SCP), différentes méthodes d'acquisition (Data-Dependent Acquisition, DDA, et Data-Independent Acquisition, DIA) et divers outils bioinformatiques (DIA-NN, MaxQuant, Proline, ProteomeDiscoverer, Spectronaut). Nous avons utilisé soit une bibliothèque de 177 phosphopeptides synthétiques de localisation connue, soit des phosphopeptides enrichis à partir de cellules T de souris. Les jeux de données obtenus à l'issue de trois expériences indépendantes ont permis d'évaluer les aspects suivants : (1) la performance de localisation à l'aide de peptides synthétiques, (2) l'impact de la compétition entre isomères de position sur la précision quantitative, et (3) la profondeur et la précision de quantification dans des échantillons biologiques complexes. Nos résultats indiquent que la présence de plusieurs isomères de position au sein d'un même échantillon, comparée à une forme isomérique unique, compromet la précision de la localisation et de la quantification, soulignant la compétition entre isomères comme une source majeure d'erreurs. Un autre résultat clé est que la stratégie DIA surpasse la DDA lorsqu'elle est couplée à des logiciels avancés. Notamment, le mode directDIA sans bibliothèque de Spectronaut a démontré des performances supérieures en termes de sensibilité, de spécificité et de précision de quantification, grâce à son approche hybride centrée à la fois sur les spectres et les peptides. DIA-NN s'est révélé moins performant, en particulier sur les jeux de données synthétiques, probablement en raison de limitations dans la prédiction spectrale des phosphopeptides. Parmi les outils DDA, MaxQuant et Proline ont montré des forces complémentaires : MaxQuant se distingue par une meilleure spécificité, tandis que Proline offre une meilleure sensibilité selon l'instrument utilisé. ProteomeDiscoverer s'est révélé performant pour l'identification des peptides, mais moins précis en termes de localisation et de quantification. Les performances varient également selon l'instrumentation. En particulier, l'utilisation de la mobilité ionique FAIMS a eu des effets mitigés : bien qu'elle tende à exclure certaines espèces et à réduire la sensibilité dans le cas de mélanges simples de phosphopeptides, elle a amélioré la détection et la quantification des phosphopeptides de faible abondance dans les échantillons complexes. Au-delà des résultats issus de cette étude de benchmarking, les jeux de données générés constituent une ressource précieuse pour la communauté scientifique. Ils pourront être réutilisés par d'autres groupes ou initiatives de standardisation pour évaluer d'autres outils logiciels, ou encore pour soutenir le développement et l'optimisation des algorithmes d'analyse des données phosphoprotéomiques.