Development and functional characterization of artificial proteins targeting the spike protein of animal coronaviruses

Titre : Développement et caractérisation fonctionnelle de protéines artificielles qui ciblent la protéine Spike de coronavirus animaux.Mots-clés : Entrée virale, antiviral, fusion membranaireRésumé : Les coronavirus animaux présentent des risques importants pour la santé vétérinaire et l'économie agricole. Le virus de la gastro-entérite transmissible (TGEV) et le virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV) provoquent une diarrhée sévère chez les porcelets, associée à des taux de mortalité élevés. Outre son tropisme entérique, le TGEV (et d'autres coronavirus animaux) peut également cibler l'épithélium respiratoire. Alors que le TGEV est désormais bien maîtrisé, le PEDV est un pathogène réémergent dont les variants sont moins sensibles aux vaccins. Le tropisme tissulaire des coronavirus animaux et le fait qu'ils échappent aux anticorps sont associés à des mutations du gène Spike. Spike est une protéine clé car elle permet l'attachement du virus aux cellules hôtes ainsi que la fusion des membranes cellulaires et virales, ce qui permet l'entrée du virus. Alors que le Spike du TGEV a été assez bien caractérisé, le fonctionnement du Spike du PEDV reste mal compris. Ma recherche principale vise à identifier des ligands synthétiques originaux capables de lier les protéines Spike du TGEV et du PEDV afin de développer une nouvelle classe d'antiviraux ainsi que des outils pour étudier le mécanisme d'action du Spike.Tout d'abord, j'ai criblé une librairie de protéines synthétiques par phage-display (les αReps) afin de découvrir des candidats potentiels qui reconnaissent et s'attachent aux Spikes de PEDV et TGEV. Nous avons utilisé comme appât la région S1 du Spike de ces virus car S1 contient des domaines fonctionnels impliqués dans l'attachement cellulaire. Les αReps TGE-D9 et PED-D12 se sont révélées capables de se lier aux particules virales TGEV et PEDV, démontrant ainsi leur capacité à reconnaître la protéine Spike « fonctionnelle » présente à la surface des virions. Pour étudier le TGE-D9, nous avons développé et caarctérisé un pseudovirus-TGEV et démontré que son entrée était inhibée par ce ligand à des concentrations de l'ordre du nanomolaire. A l'inverse, en utilisant un système rapporteur fluorescent de la fusion cellule-cellule déclenchée par le Spike de PEDV, nous avons découvert que PED-D12 augmente massivement la fusion. Il a également été démontré que PED-D12 se lie au Spike de PEDV avec une très bonne affinité, ce qui ouvre la voie à des études structurales du complexe PED-D12/PEDV Spike. Le mécanisme d'action de PED-D12 (transition d'un état de pré-fusion à un état de post-fusion dans le Spike, mimétisme des récepteurs, facilitation du clivage d'une protéase, etc.) est maintenant étudié et aidera à comprendre le fonctionnement de cette protéine.Parallèlement à mon projet principal, j'ai participé à l'étude de l'activité antivirale de petites molécules inhibitrices des cyclophilines, des facteurs cellulaires qui facilitent la réplication des coronavirus. En particulier, j'ai utilisé les systèmes viraux que j'ai développés pour étudier les coronavirus porcins afin d'évaluer l'activité anti-TGEV et PEDV d'une molécule antivirale (appelée F83233) qui a été montrée en collaboration pour inhiber puissamment l'infectivité du virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV). Cette étude met en évidence l'efficacité de cet agent ciblant l'hôte dans les cellules félines, porcines et simiennes à des concentrations non toxiques.Dans l'ensemble, mes recherches contribuent à définir les mécanismes moléculaires du fonctionnement de la protéine Spike du coronavirus et à identifier des antiviraux potentiels. Les recherches futures se concentreront sur l'amélioration de ces stratégies thérapeutiques et sur l'exploration de leur application à d'autres coronavirus, dans le but d'améliorer la santé animale et de réduire leur impact économique.