Implementation of a Biological Replicate Simulation Method for Improved Evaluation of Long-Read RNA Sequencing Analysis = Implementación de Método de Simulación de Réplicas Biológicas para una Evaluación Mejorada del Análisis de Secuenciación de ARN

El desarrollo de la transcriptómica durante las últimas décadas ha supuesto una mejora significativa para los métodos de análisis cualitativo y cuantitativo de los transcritos presentes en una célula en condiciones específicas. Un ejemplo clave fue la introducción del RNA-seq, basado inicialmente en tecnologías de secuenciación de lectura corta. No obstante, estas presentaban dificultades para capturar la complejidad del transcriptoma. Así pues, la llegada de métodos de secuenciación de tercera generación (TGS), como Oxford Nanopore Technologies (ONT) y Iso-Seq Pacific Biosciences (PacBio), permitió el uso de secuenciación de RNA de lectura larga (lrRNA-seq), mejorando la resolución y la distinción entre transcritos similares. Sin embargo, uno de los principales desafíos para esta tecnología es la capacidad para distinguir entre transcritos reales y artefactos tecnológicos. Por ello, se desarrollaron herramientas de reconstrucción de transcritos, cuyos métodos de validación presentaban limitaciones a nivel de coste, entre otras. Así, surgieron las estrategias de simulación, como SQANTI-SIM (Mestre-Tomás et al., 2023), una herramienta open-source que permite simular datos de transcriptomas con lecturas largas, incluyendo transcritos novedosos. Sin embargo, esta no contemplaba la generación de réplicas biológicas, esenciales para una adecuada evaluación estadística. Por tanto, el objetivo de este proyecto ha sido implementar un método para simular réplicas biológicas, mejorando el análisis comparativo de herramientas para lrRNA-seq. Se utilizaron muestras reales de tejido cerebral y renal de Mus musculus, secuenciadas con Iso-Seq (PacBio) y ONT y, tras un análisis exploratorio de los datos, se diseñó un modelo de simulación que estimaba previamente parámetros estadísticos, e incluía expresión diferencial y ruido biológico. La validación del modelo mediante comparaciones visuales y métricas como intensidad, variabilidad y dispersión dio resultados positivos; dando lugar a SQANTI-SIM Multisample, el cual permite simular transcriptomas con mayor realismo. En el futuro se pretende ampliar el desarrollo del modelo a nuevos tipos de muestras y escenarios biológicos. ABSTRACT The development of transcriptomics over the last decades has meant a significant improvement in the qualitative and quantitative analysis methods of the transcripts present in a cell under specific conditions. A key example was the introduction of RNA-seq, initially based on short-read sequencing technologies. However, these presented difficulties in capturing the complexity of the transcriptome. Thus, the arrival of third-generation sequencing (TGS) methods, such as ONT and PacBio, allowed the use of long-read RNA sequencing (lrRNA-seq), improving the resolution and the distinction between similar transcripts. However, one of the main challenges for this technology is the ability to distinguish between real transcripts and technological artifacts. Therefore, transcript reconstruction tools were developed, whose validation methods presented limitations in terms of cost. Thus, simulation strategies emerged, such as SQANTI-SIM (Mestre-Tomás et al., 2023), an open-source tool that allows simulating long-read transcriptome data, including novel transcripts. However, this did not contemplate the generation of biological replicates, essential for adequate statistical evaluation. Therefore, the objective of this project has been to implement a method to simulate biological replicates, improving the comparative analysis of tools for lrRNA-seq. Real samples of brain and renal tissue from Mus musculus were used, sequenced with Iso-Seq (PacBio) and ONT and, after an exploratory analysis of the data, a simulation model was designed that previously estimated statistical parameters, and included differential expression and biological noise. Validation of the model through visual comparisons and metrics such as intensity, variability, and dispersion gave positive results; resulting in SQANTI-SIM Multisample, which allows simulating transcriptomes with greater realism. In the future, it is intended to expand the development of the model to new types of samples and biological scenarios.