From Molecular Interactions to Crystal Nucleation Pathways : Leveraging Molecular Rotors and Microfluidics

La cristallisation est essentielle en pharmacie, agroalimentaire et science des matériaux. La cristallisation des protéines joue un rôle clé dans la compréhension des maladies dégénératives, la purification pharmaceutique et la biologie structurale, où la qualité des cristaux conditionne la détermination des structures atomiques par diffraction des rayons X.Malgré son importance, la nucléation – première étape du processus – reste mal comprise en raison de son caractère stochastique et de la fugacité des phénomènes impliqués. La théorie classique, basée sur l’assemblage direct de monomères en noyaux, ne suffit pas à expliquer les mécanismes impliquant des phases intermédiaires comme la séparation de phase liquide-liquide (LLPS).Cette thèse explore la nucléation des protéines à différentes échelles à l’aide de la microscopie FLIM et d’outils microfluidiques. D’abord, une approche utilisant la FLIM et le rotor moléculaire Sulforhodamine-B (SRB) est présentée pour caractériser les interactions protéine-protéine. Ces interactions influencent le diagramme de phase, déterminant ainsi les transitions de phase. Les expériences sur le lysozyme et l’albumine de sérum bovin (BSA) montrent que la durée de vie de fluorescence du SRB est un indicateur fiable de la transition entre interactions répulsives et attractives, permettant de prédire la solubilité des protéines et d’optimiser les conditions de cristallisation.Ensuite, les cinétiques de nucléation du lysozyme ont été mesurées sur une large gamme de sursaturations à l’aide d’un dispositif microfluidique contrôlé en température. Chaque gouttelette servant de réacteur indépendant, cette approche a permis d’obtenir des statistiques fiables sur la nucléation. Les résultats révèlent une rupture dans le mécanisme de formation des cristaux : les fréquences de nucléation et le nombre de cristaux par gouttelette suivent des tendances distinctes selon que l’on se trouve proche de l’équilibre thermodynamique ou de la LLPS. Aucun résultat n’est en accord avec la description classique de la nucléation. Les données suggèrent que la nucléation est favorisée par des amas moléculaires de lysozyme dont la taille augmente en s’approchant de la courbe binodale, hypothèse corroborée par la littérature et des mesures de distribution de tailles obtenues par DLS.Enfin, la combinaison de la FLIM et des outils microfluidiques permet d’étudier la nucléation cristalline en présence de LLPS. L’imagerie FLIM révèle les premières étapes de croissance des cristaux à l'intérieur ou en contact avec des gouttelettes de liquides denses. À sursaturation constante, les fréquences de nucléation montrent que la nucléation est plus lente dans les systèmes présentant une LLPS que dans des solutions homogènes. Ces résultats suggèrent que la nucléation se produit préférentiellement à l'intérieur des gouttelettes, en accord avec un modèle de nucléation non classique en deux étapes.En intégrant FLIM et microfluidique, cette thèse valide une approche expérimentale innovante pour l’étude des transitions de phase des protéines et apporte de nouvelles perspectives sur leurs mécanismes de nucléation.