Development of a New Class of Necroptosis Inhibitors That Bind Allosterically to Human and Mouse MLKL

Nekroptose ist eine Form des regulierten Zelltods, die zum Platzen der Plasmamembran, und somit zur Freisetzung von Zellbestandteilen und zur Immunantwort führt. Mixed Lineage Kinase domain-like pseudokinase (MLKL) ist das Effektorprotein, das für die Permeabilisierung der Plasmamembran bei der Nekroptose verantwortlich ist. Nekroptose ist mit einer Vielzahl entzündlicher Erkrankungen assoziiert. Aus diesem Grund ist die Inhibierung von MLKL eine attraktive Therapiemöglichkeit, da es das einzige Protein in der Signalkette ist, das ausschließlich mit Nekroptose assoziiert wird. Die Entwicklung neuer MLKL-Inhibitoren steckt jedoch noch in den Anfangsstadien und die existierenden Inhibitoren weisen viele Einschränkungen auf. Im Labor von Prof. Dr. Ana Garcia-Saez wurde eine hydrophobe Tasche in MLKL identifiziert, die als Angriffspunkt für Inhibitoren dienen könnte. Auf dieser Grundlage wurde eine neue Strategie entwickelt, um die Nekroptose gezielt zu regulieren, indem MLKL durch kleine Moleküle, die mit dieser Stelle interagieren, allosterisch gehemmt wird. Zwei Proof-of-Principle Verbindungen (MBA-h1 und MBA-m1) wurden durch in silico Analysen identifiziert. In dieser Arbeit wurden diese beiden Verbindungen in zellbasierten Assays charakterisiert: ihre inhibitorische Wirkung auf die Nekroptose, der Mechanismus, mit dem sie die Aktivierung von MLKL modulieren, und ihre Bindung an MLKL wurden bestimmt. Zusätzlich wurde ihre Wechselwirkung mit rekombinantem MLKL untersucht. Beide MBAs waren in der Lage, MLKL zu binden und die Zelltodkinetik dosisabhängig zu hemmen. Die aus den MBAs gewonnenen Erkenntnisse ermöglichten die Suche nach neuen Verbindungen mit ähnlichem Wirkmechanismus. Darauf aufbauend wurde ein erweitertes In-silico-Screening durchgeführt, bei dem potenzielle Treffer identifiziert und in vitro hinsichtlich ihrer Bindung an MLKL und Inhibierung charakterisiert wurden. Diesem Screening folgten zwei weitere Runden zur Charakterisierung von Analoga der identifizierten Treffer .Die besten Verbindungen übertrafen die bereits existierenden MLKL-Inhibitoren, da sie in der Lage waren, die Nekroptose sowohl in menschlichen als auch in Mauszellen zu hemmen. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit ein neuer Ansatz zur Hemmung der Nekroptose vorgeschlagen. Die Hemmung basiert auf einer neu identifizierten intramolekularen Interaktion in MLKL, die für seine Aktivierung essentiell ist.