Développement de sondes nanométriques pour détecter des macromolécules en microscopie cryo électronique par tomographie

La cellule eucaryote est un système compact et hétérogène et dans ce contexte, l'imagerie à haute résolution par cryo-tomographie électronique (cryo-ET) a permis de révéler des aspects structurels macromoléculaires in situ qui ne pouvait être atteint par l'analyse de molécules isolées in vitro. Cependant, dans l’environnement cellulaire encombré, l’identification de biomolécules est une tâche difficile. Pour repérer les molécules individuelles en imagerie à haute résolution, les macromolécules sont ciblées in vivo avec des sondes conjuguées à des nanoparticules d’or. Nous avons choisi l’ARN polymérase II (pol II) comme cible. La pol II est chargée de transcrire l’information stockée sous forme d’ADN en ARN messager chez les organismes eucaryotes. Aucune image à ce jour n’a permis de visualiser ou de localiser directement la pol II in situ. La détermination de l'organisation des condensats de Pol II et leur interaction avec la chromatine et les machineries d'épissage fournirait des informations essentielles sur la transcription eucaryote. Pol II est une protéine globulaire de taille moyenne, rare en dehors des sites de transcription. Le développement de procédures de marquage avec des sondes nanométriques permettrait d'obtenir sa localisation. Pour atteindre ces objectifs, j'ai abordé les défis techniques suivants : marquage in vivoVitrification complète de la cellule Amincissement des cellules pour la cryo-ET. Ces optimisations et procédures ont été intégrées dans un workflow qui m’a permis de visualiser et de localiser les particules d’or des conjugués in situ.