Rice as a production platform for valuable metabolites and recombinant pharmaceuticals for human health

La meva tesi doctoral analitza l'ús del genotip d'arròs espanyol modificat genèticament Bomba com a plataforma per a la producció de metabòlits valuosos i proteïnes recombinants per a aplicacions en salut humana. Els quatre capítols presenten diferents estratègies d'enginyeria genètica per millorar el contingut de carotenoides i l'expressió de proteïnes recombinants en l'arròs, amb innovacions que donen suport tant a la biofortificació nutricional com a la producció farmacèutica. Els tres primers capítols se centren en l'acumulació de β-carotè en el call i les llavors d'arròs, utilitzant 6M PSY1 i PDS, 6M PSY1 i CRTI, i un oligonucleòtid de 119 pb dissenyat per corregir el promotor PSY1 i PDS, respectivament, mitjançant l'estratègia d'activació SLEEPERs. Aquesta estratègia aprofita els “Promotors Silenciosos i Latents Activats en l’Endosperma” (SLEEPERs), mitjançant els quals el promotor PSY1 s’activa corregint elements cis-reguladors específics de l’endosperma. Al primer capítol, vaig identificar elements cis-actius gairebé funcionals en el promotor PSY1, que codifica l’enzim responsable del primer pas en la biosíntesi de carotenoides, però que està inactiu en l’endosperma. Es van modificar sis motius dins d’una regió de 120 pb, aproximadament a 300 pb aigües amunt del lloc d’inici de la transcripció, perquè coincidissin amb elements funcionals del promotor actiu BCH2 en l’endosperma. El promotor resultant, 4M, va aconseguir conduir l’expressió de GFP en el call i les llavors de plantes transgèniques, però no va aconseguir activar l’expressió de PSY1. Alternativament, vaig descriure una estratègia que combina el gen PSY1, regulat pel seu promotor endogen amb sis elements cis corregits, i el gen PDS, controlat pel promotor específic de teixit p-Hordein. Aquest enfocament va buscar desenvolupar línies d’arròs transgènic que coexpressessin ambdós gens per augmentar l’acumulació de carotenoides a l’endosperma de l’arròs. Al segon capítol, vaig observar que l’estratègia SLEEPERs va augmentar amb èxit l’expressió de PSY1 i, juntament amb PDS, va permetre l’acumulació de β-carotè en el call, però no en les llavors. Per abordar això, vaig substituir PDS pel gen bacterià CRTI. CRTI codifica un enzim que converteix el fitè en licopè, evitant múltiples enzims vegetals i millorant l’acumulació de carotenoides a l’endosperma de l’arròs. El tercer capítol explora el potencial de la mutagènesi dirigida per oligonucleòtids (ODM, per les seves sigles en anglès) per corregir els mateixos sis elements cis en el promotor PSY1. Utilitzant un oligonucleòtid sintètic que conté aquests elements en una configuració activa, l’estratègia buscava promoure l’acumulació de β-carotè a l’endosperma de l’arròs. Tot i que ODM no va aconseguir les modificacions desitjades, els resultats destaquen tant el potencial com els desafiaments d’aplicar aquesta tècnica en sistemes vegetals. Aquests desafiaments inclouen l’eficiència en el lliurament dels oligonucleòtids a les cèl·lules vegetals, garantir un direccionament precís i superar els mecanismes naturals de reparació de les plantes, que poden contrarestar les edicions previstes. Al capítol final, vaig investigar l’ús de l’arròs com a plataforma per a la producció de proteïnes farmacèutiques recombinants, un projecte desenvolupat en resposta a la pandèmia de SARS-CoV-19. Es va establir l’expressió del domini d’unió al receptor (RBD) de la proteïna espícula (S1) del SARS-CoV-19 en call d’arròs. La proteïna es va dirigir a l’apoplast i la seva purificació es va facilitar mitjançant una etiqueta d’histidina 6x. L’anàlisi de glicosilació de la proteïna RBD va revelar perfils de glicans diferents en comparació amb altres sistemes vegetals, cosa que subratlla el potencial de l’arròs com a plataforma per a la producció de proteïnes biofarmacèutiques amb configuracions de glicans específiques adequades per a diverses aplicacions mèdiques.