Avancées dans l'imagerie du calcium au sein d'organites intracellulaires : développement de capteurs calciques lumineux et photostables

De récentes études ont mis en évidence l'importance de la compartimentation du calcium intracellulaire (Ca2+) au sein de différents organites tel que le réticulum endoplasmique (ER) ou les mitochondries. L'étude de ces dynamiques calciques repose en grande partie sur l'utilisation de microscopes à fluorescence couplés à des senseurs génétiquement encodés très performants tels que les Green Calcium-Modulated Protein ou GCaMP. Cette famille de capteur cytosolique émet de la fluorescence verte lorsque excité par de la lumière bleue et lié au Ca2+. De ce senseur dérivent des variantes spécifiques, notamment le senseur mitochondrial mito-GCaMP et le senseur destiné au réticulum, ER-GCaMP. Pour améliorer la mesure et l'analyse des fluctuations calciques et faciliter le couplage des senseurs de type GCaMP avec d'autres senseurs, permettant ainsi l'étude simultanée des dynamiques calciques dans différents compartiments cellulaires, il est essentiel de développer des senseurs performants émettant dans le rouge et le rouge lointain. C'est dans cet objectif que nous avons mis au point un nouveau senseur chémigénétique à partir de HaloCaMP1a: Mito-HaloCaMP. Ce capteur, optimisé pour la détection du Ca2+ mitochondrial, émet une fluorescence rouge (λ_excitation = 585 nm) ou rouge lointaine (λ_excitation = 635 nm), en fonction du ligand (JF-HTL) utilisé. Nous avons démontré que Mito-HaloCaMP présente une sensibilité accrue et une intensité de fluorescence améliorée dans les cellules HeLa et les neurones, surpassant les senseurs calciques mitochondriaux rouges existants. De plus, il permet, pour la première fois dans ces longueurs d'onde, le suivi des dynamiques calciques mitochondriales dans les axones, une avancée jusqu'alors impossible avec les senseurs rouges disponibles. En parallèle, nous avons conçu une nouvelle série de senseurs à faible affinité pour le calcium (Low Affinity), désignés sous le nom de LA-HaloCaMPs, destinés à l'étude du Ca2+ dans le ER, un compartiment riche en calcium. ER-HaloCaMP reconstitué avec JF-HTL585 et JF-HTL635 présentent tous deux une sensibilité accrue, une meilleure photostabilité et une intensité de fluorescence plus élevée comparativement aux senseurs rouges existants. Ainsi ER-HaloCaMP facilite l'imagerie de structures subcellulaires particulièrement fines, telles que les épines dendritiques et les axones. Ces nouveaux senseurs chémigénétiques nous ont permis d'étudier simultanément les dynamiques calciques au sein de trois sous compartiments cellulaires: le ER, les mitochondries et le cytosol. Enfin, nous avons évalué la résistance de LA-HaloCaMP pour différentes conditions de pH dans le but de développer un senseur génétiquement encodé pour les lysosomes. Nos analyses ont révélé que LA-HaloCaMP présente une résistance partielle au pH acide, ce qui nous a conduits à explorer diverses stratégies pour optimiser sa localisation au sein des lysosomes. Malgré les défis rencontrés lors du développement de ce dernier senseur, nous espérons que ces travaux poseront les bases pour le développement futur de senseurs génétiquement encodés capables de fonctionner dans des environnements fortement acides.