développement de nanocapteurs fret (transfert d'énergie par résonance de type förster) basés sur des boîtes quantiques pour l'étude d'intéractions moléculaires au sein des adhésions focales

La compréhension des mécanismes d'assemblage et de désassemblage des structures macromoléculaires dans les cellules repose sur le décryptage des interactions biomoléculaires. Cependant, ces interactions ne sont souvent pas bien élucidées du fait que les outils permettant de suivre les dynamiques moléculaires ne sont pas suffisamment résolus dans le temps ou l'espace.Au cours de cette thèse, je me suis intéressée aux interactions biomoléculaires qui ont lieu au sein des adhésions focales (AF). Ce sont des structures multiprotéiques hautement organisées qui relient le cytosquelette et la matrice extracellulaire de la cellule. L'objectif de mon projet doctoral était de comprendre l'adhésion cellulaire à l'échelle nanométrique et de mieux comprendre les interactions entre les composants des AF. Ainsi, j'ai développé une méthode pour résoudre les interactions intermoléculaires dans la machinerie adhésive cellulaire, en utilisant des nanocapteurs FRET (Förster resonance energy transfer) basés sur des boites quantiques (QDs : Quantum Dots). FRET est un transfert d'énergie non radiatif qui se produit entre un donneur à l'état excité et un accepteur à l'état fondamental. Nos nanocapteurs ont bénéficié des avantages optiques des QDs tels que la photostabilité, la brillance ainsi que l'intervalle de distance mesurable, deux fois plus grande que celle des biocapteurs conventionnels. Pour résoudre la complexité cellulaire, les AF ont été reconstituées à l'aide d'un modèle in vitro de vésicules unilamellaires géantes (GUVs) sur lesquelles s'assemblent les protéines des AF. Ainsi, nous avons étudié la taline, une protéine semblable à un ressort connue pour se déplier sous la tension du cytosquelette. La force de traction du cytosquelette a été mimée par l'ajout d'actine et de myosine II, composants majeurs des filaments. Les filaments sont contractés par le moteur moléculaire, la myosine, ce qui entraîne l'ouverture de la structure de la taline, exposant des nouveaux sites d'interaction. Leur reconnaissance par les partenaires de la taline sert à amplifier la réponse mécanique et l'étirement de la taline.Ainsi, nos nanocapteurs FRET ont été utilisés pour quantifier les distances séparant la taline de la membrane des GUVs pour trois variantes de taline. Ces variantes diffèrent par le nombre de sous-domaines et, par conséquent, par la longueur moléculaire. Deuxièmement, nous avons étudié la mécanosensibilité de la taline, c'est-à-dire ses changements conformationnels dus à l'étirement mécanique. Les techniques de spectroscopie de fluorescence et de microscopie ont été utilisées pour quantifier les distances entre les protéines et la membrane avec une précision inférieure au nanomètre. En conséquence, les distances obtenues, pour les trois longueurs variables de taline, étaient comprises entre ~6 et 9 nm. Cependant, l'approche microscopique a facilité l'identification de deux populations distinctes de distances, dans le cas de la taline se liant à l'actine. Ensuite, l'étirement de la taline sous l'effet de la force de l'actomyosine a été mesuré. Comme précédemment, l'utilisation de la microscopie a révélé l'existence de deux populations de distance. La population la plus importante a montré une relocalisation proche de la membrane, tandis que la population mineure a démontré le contraire. En effet, la taline dimérise, ce qui reflète la plus grande population de distances observées. La contraction de l'actomyosine provoque une réduction de la distance de 2,5 nm entre l'extrémité de la taline et la membrane GUV. Ainsi, nos résultats suggèrent que dans l'AF précoce, les dimères de taline subissent un étirement dans des directions opposées et parallèle à la membrane.En conclusion, les nanocapteurs FRET basés sur les QD ont permis d'obtenir des informations quantitatives sur la dynamique d'étirement de la taline. L'application de ces outils facilitera l'élucidation de nouveaux modèles d'assemblage de la taline avec ses différents partenaires.