VALIDAÇÃO DE ENSAIOS DE PCR EM TEMPO REAL PARA GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NA FUNDAÇÃO HEMOMINAS, BELO HORIZONTE, MINAS GERAIS

Os grupos sanguíneos são definidos por conjuntos de antígenos na superfície dos glóbulos vermelhos. Após transfusão ou gravidez, pode haver produção de anticorpos contra esses antígenos, chamada aloimunização, predispondo a reações transfusionais e à doença hemolítica perinatal, respectivamente. Por essa razão, é essencial na transfusão eritrocitária garantir a compatibilidade entre doador e receptor pela fenotipagem das hemácias. Quando inconclusiva, a genotipagem pode ser usada para inferir o fenótipo a partir do genótipo identificado em testes moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR). A Fundação Hemominas realiza testes de genotipagem de grupos sanguíneos desde 2005. Os testes são realizados majoritariamente por meio de técnicas de PCR alelo-específica ou PCR/RFLP. Embora esses sejam robustos e confiáveis, tendo permitido a genotipagem de centenas de pacientes e doadores ao longo dos anos, esses métodos apresentam algumas desvantagens como a necessidade de padronização in house e a existência de múltiplas etapas até a obtenção dos resultados. Diante disso, é desejável a implantação na Fundação Hemominas de metodologia de genotipagem que permita a liberação de resultados de forma mais rápida e confiável, como a PCR em tempo real. Este estudo teve como objetivo validar etapas metodológicas para a genotipagem de grupos sanguíneos baseados em PCR em tempo real, visando a implementação do teste na rotina da Central de Imuno-Hematologia (CIH) da Fundação Hemominas, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. Foram utilizadas amostras de doadores/pacientes já fenotipados e/ou genotipados, fornecidos pela CIH. O DNA obtido dessas amostras foi usado em reações de PCR em tempo real contendo primers e sondas (Pre-designed TaqMan Assays, Thermo Fisher Scientific) específicos para cada polimorfismo de interesse. Os testes estão sendo validados para os alelos DY*A e DY*B (Diego), DO*A e DO*B (Dombrock), FY*A e FY*B e região GATA (Duffy), JK*A e JK*B (Kidd), S e s (MNS). As etapas de validação permanecem em processamento e avaliação. Os ensaios foram otimizados testando-se diferentes condições experimentais, incluindo a concentração de DNA (10 ng e 50 ng) e a temperatura de anelamento (60°C e 64°C). Para cada par de alelos, foram testadas 5 amostras conhecidamente homozigotas para um alelo, 5 amostras para o outro alelo e 5 heterozigotas, quando possível. Os resultados de amplificação, em cada uma das condições testadas, estão sendo analisados para a padronização dos protocolos de genotipagem de cada grupo sanguíneo proposto no presente estudo. A partir dos testes efetuados até o presente foi possível realizar a validação de ensaios utilizando PCR em tempo real para a detecção dos polimorfismos de antígenos eritrocitários dos sistemas de grupos sanguíneos testados (Diego, Dombrock, Duffy, Kidd e MNS). Esse método de genotipagem é mais robusto, proporciona resultados mais rápidos, menor taxa de repetição e menor geração de resíduos que a metodologia atualmente utilizada na CIH, feita por PCR convencional. Uma futura implementação na rotina beneficiará os pacientes que necessitam de transfusão por melhor compatibilização do sangue recebido, aumentando a segurança transfusional.