PCR EM TEMPO REAL NA BUSCA DE DOADORES RAROS UTILIZANDO AMOSTRAS EM POOLS

A frequência de determinados antígenos de grupos sanguíneos são diferentes entre as populações, sendo influenciada por fatores como geografia e ascendência. Devido a miscigenação entre povos e culturas, um dos maiores desafios na imuno-hematologia é identificar doadores de sangue com ausência de antígenos de alta frequência independentemente do sistema de grupos sanguíneos, podendo assim oferecer unidades compatíveis a pacientes alo imunizados. O critério utilizado por diversas associações internacionais para classificação do doador como raro é a ausência do antígeno de alta frequência ou ausência de múltiplos antígenos comuns. De maneira geral, calcula-se que apenas 1 a cada 1000 doadores apresentam estas características. Desenvolver uma metodologia molecular, baseada em PCR em tempo real (qPCR), para a triagem e identificação de doadores de sangue com ausência de antígenos de alta frequência, por meio da análise em pools com cinco doadores. Foram triados 980 amostras de doadores de sangue autodeclarado pardo/negro, organizadas em 196 pools contendo cinco amostras cada. Cada pool foi submetido à reação de qPCR visando a detecção dos alelos GYPB*P2, DO*02. –04 e KEL*02.06, utilizando sondas TaqMan específicas para cada alelo. Os pools que apresentaram amplificação para um ou mais alvos foram desmembrados, e as amostras individuais foram analisadas separadamente. Na amostra responsável pela amplificação, foi realizada PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism) para determinação do haplótipo do gene correspondente. A proporção estimada foi de 0,1% (n=980). O intervalo de confiança de 95% para esta proporção variou entre 0% e 0,298%, refletindo uma margem de erro aproximada de 0,198%. Foram triados 196 pools (100%), totalizando 980 amostras de doadores de sangue. Dentre os pools analisados por qPCR, 37 (18,8%) apresentaram resultado positivo para a presença de pelo menos um dos alelos de interesse: 18 pools (9,18%) foram positivos para o alelo KEL02.06*, 13 (6,63%) para o alelo DO02.–04* e 6 (3,06%) para o alelo GYPBP2*. Não foram identificadas amostras homozigotas para os alelos investigados. O uso da biologia molecular na busca de variantes torna esse processo mais eficiente, permitindo a detecção simultânea de dois ou mais alvos numa única reação, a depender da configuração do equipamento. Comparado à sorologia, o custo é baixo devido à capacidade de realizar múltiplas análises em uma única reação. Além disso, nem sempre há disponibilidade de soros comerciais específicos para estes antígenos, e, quando disponíveis, geralmente são oferecidos em quantidades limitadas, o que eleva ainda mais os custos e dificulta sua busca. Embora o tamanho amostral utilizado tenha sido relativamente grande, para atingir a precisão recomendada seria necessário um número aproximadamente quatro vezes maior. Apesar dessas limitações, a técnica molecular demonstra-se uma metodologia eficaz na detecção de variantes de grupos sanguíneos. A aplicação da qPCR como ferramenta para triagem de doadores com fenótipos raros demonstrou-se ser uma metodologia eficaz, rápida e de baixo custo. Quando comparada às técnicas sorológicas convencionais, a abordagem molecular permite a analise de um maior numero de antígenos ao mesmo tempo, contribuindo significativamente para a ampliação de estoques fenotipados/genotipados em bancos de sangue e para a oferta de unidades compatíveis a pacientes com aloanticorpos clinicamente relevantes.