DETECÇÃO DE CÉLULAS CAR T ANTI-CD19 POR CITOMETRIA DE FLUXO

A terapia com células CAR-T (receptor quimérico de antígeno) transformou o manejo de neoplasias hematológicas refratárias ou recidivadas, oferecendo uma alternativa eficaz para pacientes com poucas opções terapêuticas. O monitoramento dessas células no sangue periférico após a infusão permite avaliar a resposta clínica e antecipar eventos adversos, já que sua persistência está relacionada à eficácia do tratamento. Realizar a validação de dois reagentes comerciais destinados à quantificação de células CAR-T, avaliando seu desempenho técnico e sua aplicabilidade prática na rotina do Laboratório de Citometria de Fluxo. 18 amostras divididas em três grupos; 5 alíquotas da indústria (tisagenlecleucel, Novartis, Suiça, CAR-T cells), 13 amostras de sangue periférico após a infusão; 5 com diagnóstico prévio de LLA-B, 7 LDGCB e 1 linfoma folicular. Foram adquiridos de 500.000 a 1 milhão de células. A caracterização e quantificação das populações celulares foram realizadas com os anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos: CD45 FITC, CD19 CAR PE, 7AAD PerCP, CD8 APC-Cy7, CD3 APC, CD4 APC-H7 (todos da BDBiosciences) e aquisição em citômetro de fluxo BD FACSLyric (BD FACSuite™ software). Foram avaliados dois anticorpos específicos para detecção do CD19 CAR: Immunostep (Espanha), utilizado em 10 amostras e CD19 CAR conjugado à biotina da Miltenyi Biotec (Alemanha) em 8 amostras. Nenhuma normalização foi implementada na análise. Todos os dados foram dados brutos, processados e posterior análise com o software Infinicyt (Salamanca-Espanha), utilizando sequência de estratégias de gate e posterior identificação das células CAR-T, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD4+CD8+, CD3+CD4-CD8- e exclusão das células mortas pelo corante 7AAD. A análise dos dados foi realizada no programa Microsoft Excel. A mediana de intensidade de fluorescência nas alíquotas da indústria a mediana do canal de fluorescência ficou entre 15.661 a 53.007. Ambos os anticorpos avaliados foram eficazes para detecção e quantificação de células CAR-T, com marcação nítida nas amostras positivas e sem diferenças relevantes quanto à intensidade de fluorescência e sensibilidade. Apesar do potencial curativo das células T do receptor de antígeno quimérico (CAR), um número significativo de pacientes não responde, ressaltando a necessidade de monitoramento preciso do paciente. Atualmente, a avaliação das respostas em cenários do mundo real é baseada nos exames laboratoriais (doença residual mensurável nas LLA-B), exames laboratoriais de rotina e de imagem. No entanto, como a progressão da doença é rápida em pacientes fortemente tratados, a detecção precoce da perda da persistência das células CAR-T é necessária para que o tratamento de resgate possa ser iniciado mais cedo. A citometria de fluxo é um método eficiente e acessível para detecção de células CAR-T circulantes no monitoramento terapêutico de pacientes pós infusão. A disponibilidade de diferentes reagentes comerciais no mercado torna-se necessária a validação da técnica considerando desempenho, custo e aplicabilidade. Neste resumo avaliamos dois reagentes, os quais ofereceram detecção confiável de células CAR-T, com distinção clara entre expressão positiva de CAR e células negativas. Importante avaliar os custos e tempo de processamento das amostras para aplicabilidade em laboratórios de rotina.