PRODUÇÃO ESCALONÁVEL DE VETOR LENTIVIRAL CLÍNICO CAR ANTI‑CD19 DE QUARTA GERAÇÃO COEXPRESSANDO IL‑15/IL‑15RΑ PARA TERAPIAS CELULARES COM NK

Vetores lentivirais constituem ferramentas essenciais em terapias avançadas, como células CAR-T/NK e terapias gênicas, por possibilitarem modificação genética estável de células-alvo. O desenvolvimento de plataformas nacionais para sua produção é estratégico, pois reduz a dependência de importações, diminui custos e fortalece a capacidade do país em terapias avançadas. A transdução com lentivírus é amplamente empregada em estudos clínicos com células CAR devido à sua alta eficiência em células quiescentes ou em divisão e à integração genômica que garante expressão sustentada. A produção de vetores lentivirais envolve etapas upstream, com transfecção de células empacotadoras e coleta do sobrenadante viral, e downstream, para purificação e concentração das partículas. A filtração tangencial (TFF) aplicada no downstream permite concentração, troca de tampão e preservação da integridade viral em processo escalonável e compatível com uso clínico. Este estudo teve como objetivo estabelecer uma plataforma nacional para produção de vetor lentiviral clínico de quarta geração, projetado para expressão de CAR anti‑CD19 com coexpressão de IL‑15/IL‑15Rα em células NK. No upstream, células HEK293‑T/17 em sistema multicamadas Cell Factory foram transfectadas com 0,34 µg/cm² de plasmídeo (3:1:1:1; CAR e acessórios 1‑3) e agente de transfecção (1:1 DNA:PEI). Após 48 h, o sobrenadante viral foi coletado (n = 3 lotes) e clarificado em filtro de 0,5 µm. No downstream, utilizou-se o sistema KrosFlo® KR2i TFF (Repligen) em duas etapas: concentração inicial (10‑11x)/diafiltração (7 DV) com membrana 500 kD MiniKros e concentração final (10‑25x) com membrana 500 kD MidiKros. Os rendimentos médios nas diferentes etapas foram: clarificação 108,6% (± 26,2%), concentração inicial 56,7% (± 20,1%), diafiltração 84,5% (± 47,3%) e concentração final 126,4% (± 78,6%). O vetor final apresentou título médio de 1,05×10⁷ TU/mL e pureza adequada para uso clínico, com remoção de 97% do DNA residual e 98% da proteína de célula hospedeira. Ensaios funcionais demonstraram transdução eficiente de células NK primárias (MOI 10), com frequências de 42,3% (± 0,57%) e 14,3% (± 1,13%) de células NK‑CAR anti‑CD19 nos dois lotes testados. A plataforma desenvolvida gera vetores lentivirais escalonáveis e de alta qualidade compatíveis com Boas Práticas de Fabricação (BPF), constituindo um passo estratégico para produção nacional de células CAR-NK de quarta geração, com impacto direto no avanço de terapias celulares para leucemias e linfomas no Brasil. PRONON 25000.021774/2019‑13; FINEP 01.24.0656.00 Ref: 0238/24; FAPESP 2020/07055‑9.