ESTUDOS FUNCIONAIS DA HEMOGLOBINA DE INDIVÍDUOS COM ERITROCITOSE NÃO-ESCLARECIDA

O diagnóstico das eritrocitoses é desafiador devido à diversidade de causas. Apesar da investigação extensiva às suas causas mais comuns, há casos que seguem sem elucidação. Hipotetizamos que eventuais alterações da hemoglobina (Hb), mesmo na ausência de variantes, possam contribuir para o quadro, devido a possíveis efetores moduladores da função da proteína. Estudar a interação Hb-O2 de indivíduos com eritrocitose secundária não-esclarecida para futuros estudos de ômica. A Hb total (hemolisado stripped) foi extraída e purificada de sangue periférico (EDTA) de 3 indivíduos atendidos no Hemocentro da UNICAMP, via cromatografias de exclusão molecular (Sephadex 25G - Sigma-Aldrich; USA) e de troca iônica (Amberlite MB3; Sigma-Aldrich; USA). Os pacientes e 1 indivíduo saudável (controle) assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (CAAE:4034123.1.0000.5404). Excluíram-se clinicamente e por exames específicos, as principais causas de eritrocitose, como alterações cardiopulmonares e renais, neoplasias, tabagismo e mutações como JAK2V617F. Excluíram-se a presença de Hb variantes por eletroforese capilar (Sebia; Evry, França) e HPLCs de troca iônica (Variant II - Bio-Rad; EUA) e de fase reversa (Alliance, Waters; EUA). A função da Hb foi determinada por curvas de dissociação do O2 (CDO; triplicata experimental), em ensaios espectrofotométricos-tonométricos (DU 800, Beckman Coulter-Fullerton; EUA) a 25°C, 70 uM de Hb, nos pHs 6,5, 7,5 e 8,5 com e sem Inositol Hexafosfato (IHP - 1 mM), efetor alostérico mimético ao 2,3-BPG. Determinou-se a P50 para avaliação da afinidade Hb-O2, Efeito Bohr e cooperatividade heme-heme por cálculo de Constante de Hill (n). Os pacientes (P) apresentaram os seguintes perfis hematimétricos: P1: GV:5,69 106/mm3; Hb:14,6g/dL; Ht:44,4%; VCM:78fL; HCM:25,7pg; RDW:13,2; P2: GV:5,68 106/mm3; Hb: 17g/dL; Ht:47,8%; VCM:84,2fL; HCM:29,9pg; RDW:12,7; P3: GV:6,39 106/mm3; Hb:18,6g/dL; Ht:53,8%; VCM:84,2fL; HCM:29,1pg; RDW:12,2. Os valores de P50 (mmHg) da Hb stripped nos pHs 6,5 , 7,0 e 7,5 foram: P1:1,5 (±0,4), 1,1(±0,3), 0,7(±0,0); P2:1,4(±0,3), 0,9(±0,1), 0,6(±0,1); P3:2,1(±0,6), 1,0(±0,3), 0,5(±0,3) e controle:1,7(±0,8), 0,7(±,0,5) e 0,6(±0,4), sem diferenças significativas. No entanto, houve diferenças entre as P50 das amostras na presença de IHP, particularmente no pH7,5, quando comparadas ao controle: P1:48,4( ±5,3), 23,2( ±8,8), 6,6( ± 2,2); P2:44,5( ± 4,7), 31,3( ± 2,9), 10,5 (± 2,0); P3:60,6(±13,0), 33,8(±4,9), 7,3(±1,3) e controle:59,4(±7,0), 41,1(±6,1), 16,5(± 6,8). A cooperatividade n dos hemolisados stripped revelaram variações, como na amostra controle: P1:1,4(±0,5), 2,1(±0,8), 1,6(±0,1); P2:1,5(±0,4), 1,6(±0,4), 1,5(±0,2); P3:1,4(±0,1), 1,5(±0,0), 1,4(±0,2) e controle:1,5(±0,2), 1,4(±0,4), 1,6(±0,1). Na presença de IHP: P1:1,3(±0,2), 1,9 (±0,3), 2,1(±0,4); P2:1,5(±0,0), 1,8(±0,1), 2,6(±0,3); P3:1,4(±0,2), 1,7(±0,1), 2,1(±0,2) e controle:1,4(±0,1), 1,6(±0,1), 2,2(±0,1). Observou-se alterações no perfil Hb-O2 em hemolisados de pacientes com eritrocitose, na presença de IHP, mesmo sem Hbs variantes. Permanece a hipótese da presença de compostos que alteram a afinidade da Hb em eritrocitose idiopática. Casos adicionais serão estudados e análises ômicas realizadas para elucidar a presença de compostos que resultem na alteração funcional observada. Portanto, o estudo da interação Hb-O2 possibilitou identificar casos elegíveis para estudos ômicos, auxiliando na investigação da etiologia da eritrocitose não-esclarecida.