MODELAGEM DA MUTAÇÃO TP53R175H EM IPSC DERIVADA DE NEOPLASIA MIELOPROLIFERATIVA COM CALRDEL52

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) são distúrbios clonais da célula-tronco hematopoética, originados a partir de uma de três mutações principais: JAK2V617F, CALR (indels), ou mutações em MPL. O mecanismo patogênico comum entre essas mutações é a ativação constitutiva da via JAK/STAT, resultando em uma produção excessiva de células mieloides. Esses distúrbios crônicos podem progredir para leucemia mieloide aguda secundária (LMA-s), com prognóstico desfavorável. Mutações no gene TP53 estão associadas a uma maior taxa de transformação de NMPs para LMA-s e menor sobrevida global. Pelo menos um terço dos casos de LMA-s apresentam inativação bialélica de TP53, frequentemente por uma combinação de mutação somática e perda alélica. Entre as mutações hotspot de TP53, a R175H é a mais frequente no câncer. Em geral, as mutações em TP53 levam a perda da função canônica desse fator de transcrição, em contrapartida algumas mutações missense entre elas R175H podem levar a um ganho de função (GOF) oncogênica, como proliferação, invasão, migração e metástase. Pouco se sabe sobre seu papel em malignidades hematológicas. Este estudo tem como objetivo analisar o impacto da mutação TP53R175H no panorama transcricional de células modelo de NMP. Para tanto, usamos CRISPR-Cas9 em iPSC derivada de paciente com NMP com CALRdel52 para gerar linhagens knock-in (KI) para TP53R175H. Após edição gênica, iPSCs CALRdel52 portadoras do KI em homozigose (TP53R175H/R175H) ou hemizigose (TP53R175H/frameshift) foram estudadas. Linhagens isogênicas expressando p53 selvagem (TP53WT) e sem expressão de p53 (p53 KO) foram utilizadas como controle. As iPSCs controle e mutantes para TP53 foram tratadas com Nutlin-3, um antagonista de MDM2, por 6 horas. A expressão proteica de p53 foi avaliada por Western Blot. Sua função canônica como regulador transcricional foi avaliada por meio da análise da expressão gênica de alvos conhecidos de p53, por qPCR usando SYBR no equipamento Viia 7. Neste trabalho, geramos linhagens iPSC modelo de NMP portadoras de CALRdel52 e TP53R175H em homozigose ou hemizigose. A análise por sequenciamento de Sanger confirmou a introdução da mutação na região de interesse e não houve edição inespecífica nas seis regiões avaliadas. A expressão do alelo TP53R175H foi detectada em por sequenciamento de cDNA. Após o tratamento com Nutlin-3, iPSC CALRdel52 TP53WT expressaram p53, enquanto a linhagem p53 KO não mostrou nenhuma expressão proteica. As linhagens portadoras de TP53R175H apresentaram expressão de p53 mesmo na ausência de tratamento. A seguir, os níveis de expressão dos genes alvo foram quantificados. Após o tratamento com Nutlin-3, as células TP53WT apresentaram indução significativa dos alvos de p53: CDKN1A (59,2 vezes), BBC3 (13,8 vezes), PMAIP1 (3,8 vezes), BAX (3,3 vezes). Esta resposta transcricional foi severamente comprometida em linhagens com TP53R175H. Esses resultados demonstram que as células CALRdel52 KI TP53R175H não possuem atividade transcricional canônica de p53, apesar da expressão da proteína mutante. Como perspectiva, utilizaremos estes modelos para entender o impacto de TP53R175H no panorama transcricional por RNAseq e assim acessar possíveis ganhos de função (GOF) em células hematopoéticas CALRdel52. Portanto, esse estudo pode auxiliar a esclarecer mecanismos moleculares de transformação leucêmica nas NMPs.