AVALIAÇÃO DO PERFIL PRÓ-INFLAMATÓRIO DE LINFÓCITOS T MODIFICADOS GENETICAMENTE PELA TECNOLOGIA CAR-T

A imunoterapia com células CAR-T utiliza linfócitos T modificados ex vivo para reconhecer e eliminar células leucêmicas. As sequências gênicas do receptor antigênico quimérico (CAR) são inseridas no genoma dos linfócitos utilizando vetores lentivirais, um processo que exige um metabolismo celular ativo durante a transferência gênica. Comumente, a ativação de escolha é mediada por sinais ao TCR e receptores coestimulatórios, o que induz o aumento do metabolismo, progressão no ciclo celular e proliferação clonal. Em contrapartida, estes sinais conduzem o linfócito a um fenótipo efetor, caracterizado por alta liberação de citocinas pró-inflamatórias. Hipotetizamos que este mecanismo pode estar relacionado com efeitos adversos da terapia CAR-T, incluindo a síndrome de liberação de citocinas (CRS). Protocolos de ativação alternativos podem ser uma abordagem de interesse para estimular o metabolismo celular, permitindo a transdução sem desencadear alteração de fenótipo. O estudo investigou se a substituição de estímulos ao TCR por um protocolo alternativo de ativação metabólica de linfócitos T – baseado em um coquetel de citocinas associadas à homeostase linfocitária – poderia tornar essas células permissivas à transdução lentiviral sem induzir um perfil pró-inflamatório nos linfócitos manipulados e, por consequência, em células do sistema imunológico inato. A proposta visou avaliar o potencial deste protocolo como uma estratégia para mitigar os efeitos adversos associados à terapia CAR-T. Linfócitos T de doadores saudáveis foram divididos em três grupos: (I) LNA: Linfócitos não ativados; (II) TCR: Linfócitos ativados via TCR por anticorpos anti-CD3/CD28; e (III) ALT: Linfócitos ativados alternativamente por um coquetel de citocinas (IL-2, IL-7 e IL-15). Os grupos foram transduzidos com um vetor lentiviral codificante para GFP e a eficiência foi avaliada por citometria de fluxo (CF), com base no percentual de células GFP+. A capacidade pró-inflamatória foi comparada pela análise dos marcadores CD25 e CD69 por CF, além da dosagem de IFN-γ e TNF-α por ELISA. Para avaliar a influência destes protocolos sobre o sistema imunológico inato, foi realizada cocultura indireta de monócitos com o sobrenadante dos linfócitos, e a secreção de IL-6 e TNF-α monocíticas foi quantificada por ELISA. A ativação alternativa de linfócitos viabilizou a transdução lentiviral enquanto manteve menor efeito pró-inflamatório, sem aumento dos marcadores CD69 e CD25 ou das citocinas IFN-γ e TNF-α. Em contraste, a ativação via TCR induziu estado efetor, com elevação significativa dos parâmetros analisados. Além disso, as altas concentrações de citocinas secretadas pelo grupo TCR induziram a ativação de monócitos, o que desencadeou a liberação de IL-6 e TNF-α, um perfil compatível com a CRS. Já a ativação alternativa não induziu estimulação monocitária, indicando menor propensão ao desenvolvimento da síndrome. A terapia com células CAR-T é eficaz, mas limitada por efeitos adversos. Neste estudo, mostramos que a ativação de linfócitos T por sinais homeostáticos permite transdução eficiente sem induzir secreção excessiva de citocinas pró-inflamatórias. Ao contrário do estímulo via TCR, essa abordagem não estimula o sistema imunológico inato, sugerindo uma estratégia mais segura para lidar com os efeitos adversos desta imunoterapia.