SEPARAÇÃO POR FICOLL HYPAQUE DAS FRAÇÕES LINFOMONONUCLEAR E GRANULOCÍTICA PARA ANÁLISE DO QUIMERISMO NAS DIFERENTES POPULAÇÕES CELULARES

No transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênico, o quimerismo completo, ou seja, a presença de células sanguíneas apenas do doador, pode evitar rejeição do enxerto e recidiva da doença de base. Células residuais do paciente e células do doador são quantificadas no sangue periférico ou na medula óssea de maneira seriada pela análise de repetições curtas em tandem (STR), pequenas repetições em tandem dispersas no genoma humano, com grande variabilidade entre os indivíduos. A presença de quimerismo misto em granulócitos ou linfócitos, dependendo da doença de base do paciente, pode guiar a terapia com aumento ou redução da imunossupressão e até mesmo indicar a infusão de linfócitos do doador para evitar a rejeição e recidiva da doença. Devido ao alto custo dos métodos de separação imunológicos (colunas biotina/avidina) ou baseados em citometria de fluxo (sorting) e a ampla disponibilidade da separação por ficoll-hypaque no serviço, esta metodologia foi implantada no serviço na monitorização de doenças não malignas após o transplante. Relatar nossa experiência no monitoramento do quimerismo em amostras de DNA extraídas das células linfomononucleares e granulócitos de pacientes submetidos ao transplante alogênico. Foi utilizada amostra de sangue periférico coletada em edta e diluída na proporção 1:1 em solução fisiológica. O produto foi adicionado cuidadosamente acima da camada de solução de ficoll em um tubo de polietileno com capacidade para 15ml e levado a uma centrifugação baixa (1600 rpm ou 400 g) por 30 minutos. Durante a centrifugação ocorre uma migração diferencial resultando na formação de camadas de células linfomononucleares e granulócitos bem diferenciadas. Com o auxílio de uma pipeta graduada de 2 ml, a camada linfocitária foi transferida para um tubo e granulócitos para outro tubo. As células foram ressuspensas em solução fisiológica e realizada duas centrifugações a 3000rpm, por 10 minutos, à temperatura ambiente, com freio para lavagem do sobrenadante. O STR foi realizado através da amplificação simultânea de 24 locos STR por PCR (reação em cadeia da polimerase) e eletroforese capilar, utilizando o kit GlobalFiler®PCR, um painel multiplex de 24 locos STR, sendo 21 autossômicos e 3 loci dos cromossomos sexuais. A eletroforese capilar foi realizada no Genetic Analyzer 3500® e os dados foram analisados qualitativa e quantitativamente no software GeneMapperIDX1.4®. No período de dezembro de 2021 a junho de 2025 realizamos o total de 80 separações da fração linfomonuclear e granulocitica de amostras de sangue periférico de 28 pacientes. A mediana de idade foi de 8 anos (1–23), 61% do sexo masculino. Os pacientes coletaram uma mediana de duas amostras em momentos distintos, variando de uma a sete coletas. Foram detectados 15 quimerismos completo, 18 mistos apenas na linhagem linfomononuclear, 45 mistos na linhagem granulocítica. Somente 3 amostras tiveram resultados inconclusivos, 1 na linhagem linfomononuclear e 2, granulocítica. A quantidade de células linfomononuclear pós ficoll enviadas para o STR foi de 4 × 10 6 /mL (0,6-13) e granulocítica 3 × 10 6 /(0,5–9). A separação de células por gradiente de densidade por ficoll hypaque para avaliar quimeirismo é factível e excelente estratégia para determinar a necessidade de exames complementares mais específicos.