A CRIOPRESERVAÇÃO DE MONÓCITO RETIRADAS DE BOLSAS DE BUffYCOAT. UMA FERRAMENTA VIÁVEL PARA A EXECUÇÃO DO MMA

A técnica de MMA (Ensaio de Monocamada de monócito), técnica que auxilia na prevenção de reações hemolíticas pós transfusionais, utiliza células de bolsas de sangue total contendo alta concentração de leucócitos para o isolamento dos monócitos. Essa etapa é extremamente importante e impacta diretamente na realização da técnica uma vez que as amostras precisam ser frescas para que as células estejam funcionais, porem nem sempre a oferta de bolsas nessa condição condiz com a urgência da realização da técnica. Aperfeiçoar a parte da obtenção das células, bem como compreender a metodologia e manuseio é fundamental para garantir a integridade e viabilidade das células. Esse trabalho tem como objetivo padronizar a criopreservação desses monócitos para uso posterior nos ensaios de MMA, e avaliar as condições de integridade e eficiência dessas células após um período de congelamento. O procedimento de congelamento dos monócitos evolve varias etapas importantes para garantir uma boa viabilidade. Primeiramente as células são isoladas a partir de uma bolsa contendo 89 ml residuais de buffy-coat, provenientes das bolsas de sangue total coletadas no mesmo dia; essas células são lavadas para remoção dos resíduos, e então ressuspensas em meio RPMI em uma concentração 3,7 × 107 monocito/ml. Nessas células então são adicionadas uma solução crioprotetora, (mistura de RPMI 1640 40%, solução fetal bovina 40% (inativado) e DMSO 40%), e submetidas a um resfriamento gradual no freezer (24 horas) e depois passando ao congelamento em nitrogênio liquido. O descongelamento dessas células ocorreu após três meses, onde os tubos foram colocados em banho-maria 37°C. Após completo descongelamento as células foram lavadas em meio RPMI previamente aquecidas, analisadas em microscópio ótico digital, para ver a viabilidade através do uso do Azul de Tripan, e a funcionalidade foi testada através do ensaio de MMA com amostras conhecidamente positivas e utilizando amostra buffy-coat contendo 94 ml no mesmo dia usadas em paralelo. As analises do impacto da criopreservação foram realizadas em paralelo com amostras de monócitos frescos. Os resultados de viabilidade indicaram uma degradação mínima nas amostras congeladas quando comparadas a amostra fresca e aos dados anteriores a criopreservação. Com relação a efetividade celular, tanto as células frescas quanto as congeladas foram submetidas ao MMA contra hemácias sensibilizadas com anti-D e o resultado obtido foi o mesmo em ambos os grupos. O congelamento de monócitos proveniente de bolsas de Buffy-coat frescas demonstrou manter a viabilidade e funcionalidade próxima a inicial. O congelamento se torna uma ferramenta valiosa, auxiliando na aplicação da técnica de MMA, tornando a técnica mais flexível, não dependendo da presença de doadores de sangue total para a execução da técnica, e facilitando para que centros que não tem uma coleta tão significativa consiga executar o MMA a qualquer momento, a partir das células congeladas.