ANÁLISE DE NOVOS VETORES PARA EXPRESSÃO DO CAR-ANTI-BCMA PARA TRATAMENTO DO MIELOMA MÚLTIPLO

O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia de plasmócitos que acomete cerca de 2,1 a cada 100.000 pessoas no mundo e conta cerca de 10% dos tumores hematológicos. Apesar do avanço em terapias para MM, os pacientes ainda apresentam recidivas, sendo assim, o MM se mantém incurável. A terapia celular com células CAR-T específicas para BCMA, um receptor expresso exclusivamente por células B maduras cuja expressão se mantém no MM, são capazes de melhorar a sobrevida dos pacientes e atrasar as recidivas do câncer. Dois produtos com células CAR-T já foram aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) e um deles também foi aprovado pela ANVISA o Carvikty®. Apesar da boa resposta dos pacientes, os tratamentos disponíveis apresentam baixa duração, com a mediana das recidivas sendo 8° mês pós-infusão de células. Por conta disso, nosso objetivo foi avaliar a eficácia de novas construções de receptores CAR no combate às células de MM. Nós iniciamos uma coorte de pacientes com mieloma múltiplo (MM) recém-diagnosticados (RD), que ainda não iniciaram nenhum tratamento para doença, e pacientes que estão em período de mobilização para tratamento com autotransplante. Separamos linfócitos T por seleção negativa em coluna magnética, e expandimos as células utilizando dois protocolos testamos dois protocolos de expansão, utilizando apenas baixas concentrações de IL-2 (30 U/mL), ou utilizando um coquetel de IL-2 (30 U/mL) e IL-7 (2,4 ng/mL). As células foram plaqueadas com as citocinas citadas acima, e com uma matriz com anti-CD3 e anti-CD28. No dia seguinte, as células foram transduzidas com a multiplicidade de infecção (MOI) de 5. A expansão seguiu até o dia 10-14, com traocas de meio regulares nesse período. Por fim, as células foram marcadas para análise de citometria de fluxo quanto a expressão do CAR, aos subtipos de linfócitos gerados (CD4, CD8, naive, efetora, memória central e efetora de memória). Adicionamente, também realizamos um ensaio de citotoxicidade. Para isso, as células CAR-T geradas foram incubadas na proporção de 1:1 com células de linhagens de mieloma múltiplo que expressam luciferase por 24 horas. Após esse período, adicionamos luciferina ás culturas e aferimos a emissão de luminescência. Com relação a expansão de células, Obtivemos cerca de 10x de expansão em placas de cultura convencionais e até 35x no biorreator G-REX. Em relação a transdução celular, apesar da variação intra-experimental, observamos a expressão de CAR em todas as condições, sem diferença entre os diferentes protocolos de expansão. As células geradas com o protocolo de expansão foram principalmente células T de memória efetora e células T de memória central. Observamos ainda uma tendência de maior percentagem de células T de memória central utilizando o protocolo de expansão com coquetel de IL-2 e IL-7. Por fim, avaliamos o potencial de citotóxico das células CAR-T in vitro , por meio do cocultivo das células CAR-T com linhagens de MM, MM1.S e U266. as células apresentaram grande potencial citotóxico, levando a lise acima de 80% na maior parte das condições. Com esses dados, nós demonstramos potencial de expansão de células proveniente do sangue periférico de pacientes com MM em diferentes momentos de tratamento. Além disso, geramos principalmente células de memória com grande potencial de antitumoral in vitro .