DIFERENCIAÇÃO ERITROCITÁRIA IN VITRO A PARTIR DE CÉLULAS-TRONCO DE PLURIPOTÊNCIA INDUZIDA UTILIZANDO CORPOS EMBRIOIDES: ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTOCOLO

A diferenciação eritrocitária a partir de células-tronco de pluripotência induzida (iPSCs) tem se consolidado como abordagem promissora frente à crescente demanda por sangue e às limitações associadas à dependência de doadores. Diante da escassez global de bolsas e das restrições de armazenamento, a produção de eritrócitos ex vivo a partir de iPSCs surge como alternativa viável para aplicações em pesquisa e suprimento experimental. Esse modelo permite gerar eritrócitos sob condições biológicas controladas, favorecendo estudos em hematologia, infecções e modelagem de doenças. Além disso, supera limitações de métodos baseados em células mononucleares de sangue periférico, como baixa enucleação, variabilidade entre amostras e necessidade contínua de doadores. Este trabalho visa desenvolver e caracterizar um protocolo eficiente de diferenciação eritroide in vitro a partir de iPSCs, utilizando corpos embrioides (EBs) como etapa inicial, com foco na geração de reticulócitos maduros. Os EBs são estruturas tridimensionais formadas em suspensão, derivadas de iPSCs, que mimetizam os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário e permitem a diferenciação celular nos três folhetos germinativos: ectoderma, mesoderma e endoderma, o que favorece a indução da linhagem hematopoética. Foram utilizadas linhagens de iPSCs geradas em nosso laboratório. As células foram cultivadas até 80% de confluência, dissociadas com enzyme-free para formar aglomerados de 30–50 células e plaqueadas em meio StemFlex, em placas ultra-low attachment , para formação dos EBs, induzidos à diferenciação após 24 horas. O protocolo foi estruturado em três etapas. Na fase 1, os EBs permaneceram em suspensão em meio RPMI com KOSR, BMP4, IWP2, VEGF, Y-27632 e b-FGF, promovendo o comprometimento mesodermal. Na fase 2, foram transferidos para placas aderentes e cultivados com BMP4, VEGF, b-FGF, SCF, IGF-2, heparina, IBMX e SR1, favorecendo a expansão hematopoiética. Na fase 3, utilizou-se transferrina, insulina, nitrato ferroso, 1-tioglicerol, eritropoietina, hidrocortisona, SCF, IL-3 e F68 para indução da diferenciação eritroide e maturação. Os dados parciais obtidos por citometria de fluxo revelaram, no dia 16 após o início da diferenciação, expressão significativa de CD71, níveis mínimos de CD36 e marcação discreta de CD235a, condizente com estágio intermediário da eritropoiese. Já no dia 23 pós indução, observou-se queda acentuada de CD71 e aumento expressivo de CD235a, indicando progressão para os estágios finais de maturação, com regulação negativa de CD71 e manutenção de CD235a, característica de reticulócitos. Embora os resultados iniciais tenham se mostrado positivos, buscamos, como perspectiva futura, otimizar e consolidar um protocolo reprodutível e com bom rendimento para a geração de reticulócitos maduros, a fim de que possam ser aplicados como modelo em estudos e em abordagens voltadas à limitação de acesso a sangue para fins laboratoriais e clínicos.