OBTENÇÃO DE CADEIAS DE HEPARINA DE MAIOR PESO MOLECULAR COMFILTRO ÂMICON: UMA AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA

A heparina é distribuída mundialmente como anticoagulante, com indicações para prevenir eventos tromboembólicos, assim como evitar formação de coágulos em cirurgias e hemodiálise. Quimicamente, pertence a classe dos glicosaminoglicanos, sua estrutura é formada por cadeias alternadas de um dissacarídeo sulfatado e ácido idurônico, que pode apresentar variação do nível de sulfatação e tamanho de cadeia. A atividade anticoagulante é dada pela interação com fatores da cascata de coagulação, especialmente antitrombina, trombina, fator Xa, IXa, XIa e XIIa, sendo que cadeias maiores e mais sulfatadas apresentam maior interação. As formulações a base de heparina mais utilizadas são: heparina não fracionada (HNF), com peso médio de 15 KDa; e heparina de baixo peso molecular (HBPM), com 5KDa, entretanto, formulações com maior peso molecular e atividade anticoagulante sejam escassas. Comparar o nível de sulfatação e o peso molecular de uma heparina de maior peso (HP) obtida por filtração com filtro de 10 KDa com a HNF. HNF foi obtida comercialmente (Hepamax S®), e para obtenção da heparina de maior peso, a HNF foi filtrada com um filtro de 10KDa e o material retido foi ressuspendido e utilizado como amostra (HP). A seguir foram feitas análises utilizando eletroforese em gel de agarose 0,6% com tampão PDA (0,05 M, pH 9,0) para obter o perfil eletroforético; e com o sistema descontínuo, utilizando tampão Ba/PDA (40 mM ph 5,8/PDA 50 mM pH 9,0), para avaliar a motilidade de acordo com a sulfatação. Além disso, o peso molecular também foi avaliado por cromatografia de gel filtação utilizando coluna GPC Biosep Sec-S 3000. A partir das eletroforeses, vemos que as heparinas possuem perfil de migração semelhante, com diferenças sutis em ambos os experimentos. Na eletroforese com tampão PDA, vemos que a HNF apresentou uma banda mais difusa, devido a sua alta heterogeneidade de cadeias, enquanto a HP possui uma banda mais definida. Já no sistema Ba/PDA, elas demonstraram perfil de migração semelhante com frações Slow (S), Intermediate (I) e Fast (F), a qual a HNF apresentou 46,15% de fração S, 10,96% de I e 42,89% de F, já a HP obteve 48,69% de S, 12,6% de I e 38,71% de F. Em relação a cromatografia, o volume de eluição da HNF foi 9,44 mL e da HP 9,36 mL, corroborando que a HP possui cadeias maiores, embora a diferença não seja expressiva. Diferentes heparinas, como a HNF e HBPM, possuem mecanismos distintos, assim como vantagens e limitações na clínica médica. A HNF é constituída de moléculas heterogêneas, que apresentam cadeias S e F, e devido a fração S possuir cadeias e níveis de sulfatação maiores, são capazes de interagir com diversos fatores da cascata de coagulação, e formar complexos ternários com a antitrombina e trombina, promovendo um efeito anticoagulante significante. Já a HBPM, é obtida a partir da despolimerização da heparina, e constituída apenas de frações F, que possuem cadeias menores e interagem apenas com o fator Xa, caracterizando uma atividade antitrombótica limitada. A obtenção de uma heparina livre de cadeias de baixo peso, está associada com um maior nível de sulfatação, e consequentemente, maior atividade anticoagulante, que na clínica médica seriam utilizadas em situações especificas, como coagulação intravascular disseminada (CID), onde apenas a HNF não é suficiente. Portanto, concluímos que o uso de filtro de 10 KDa não foi sensível para desprezar cadeias de menor peso molecular.