REJUVENATING HALLMARKS OF AGEING BY MODULATING PROTEOSTASIS AND MITOCHONDRIAL ACTIVITY

Introduction. Aging is characterized by cellular decline driven by hallmark processes such as loss of proteostasis and mitochondrial dysfunction. These impairments contribute to toxic protein accumulation, oxidative stress, and tissue degeneration. While transient expression of reprogramming factors (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc; OSKM) has been proposed to reverse age-associated dysfunction, the precise temporal dynamics of rejuvenation remain unclear. Aim. The study aims to determine the temporal windows of proteostasis and mitochondrial function restoration in senescent human fibroblasts during partial OSKM reprogramming. Materials and Methods. Senescent human lung fibroblasts were engineered to express OSKM under doxycycline control. Restoration of proteostasis was assessed using the Proteasome-Glo™ Cell-Based assay to measure chymotrypsin-like, trypsin-like, and caspase-like proteasomal activities. Mitochondrial activity was evaluated through measurement of reactive oxygen species using MitoSOX Red dye and flow cytometry. Data were analyzed by comparing induced and senescent control cells, with statistical testing to establish significance. Results. OSKM induction led to a time-dependent restoration of proteostasis. By day 5, proteasomal activities were significantly elevated in OSKM-induced cells compared to senescent controls (chymotrypsin-like activity increased from 48,976 to 128,078 RLU; trypsin-like activity from 12,222 to 42,333 RLU; caspase-like activity from 32,614 to 126,628 RLU). Mitochondrial rejuvenation occurred later, with ROS levels significantly reduced by day 10, reaching values comparable to young fibroblasts (p < 0.001). These results highlight distinct temporal windows for the recovery of proteostasis and mitochondrial function. Conclusion. Partial reprogramming via transient OSKM expression can effectively reverse key hallmarks of aging in senescent fibroblasts. Proteostasis is restored within 5 days, followed by mitochondrial functional recovery at 10 days, suggesting a sequential rejuvenation process. These findings provide critical temporal insights for optimizing reprogramming-based interventions and support the development of clinically translatable rejuvenation strategies. Кіріспе. Қартаю протеостаздың бұзылуы және митохондрия дисфункциясы сияқты негізгі үдерістерден туындайтын жасушалық нашарлаумен сипатталады. Бұл бұзылыстар уытты ақуыздардың жиналуына, тотығу стрессіне және тіндердің дегенерациясына ықпал етеді. Репрограммалау факторларының уақытша экспрессиясы (Oct4, Sox2, Klf4 және c-Myc; OSKM) жасқа байланысты дисфункцияны жою үшін ұсынылғанымен, жасару үдерісінің нақты уақыттық динамикасы әлі анық емес. Мақсаты. Зерттеу OSKM арқылы ішінара репрограммалау кезінде адамның сенесцентті фибробласттарында протеостаз бен митохондриялық функцияның қалпына келуінің уақыттық шектерін анықтауға бағытталған. Материалдар мен әдістер. Адамның қартаюдағы өкпе фибробласттары доксициклиннің бақылауымен OSKM экспрессиясы үшін модификацияланды. Протеостаздың қалпына келуін Proteasome-Glo™ жасушалық талдауын қолданып, химотрипсинтәрізді, трипсинтәрізді және каспазатәрізді протеасомдық белсенділікті өлшеу арқылы бағалады. Митохондрия белсенділігі MitoSOX Red бояғышын және ағымдық цитометрияны қолдана отырып белсенді оттегі түрлерін өлшеу арқылы анықталды. Деректер OSKM индукцияланған және қартаюдағы бақылау жасушаларын салыстыру арқылы, маңыздылығын анықтау үшін статистикалық өңдеумен талданды. Нәтижелер. OSKM индукциясы протеостаздың уақытқа тәуелді қалпына келуіне әкелді. 5-ші күнге қарай OSKM-индукцияланған жасушаларда протеасома белсенділігі қартаюдағы бақылау жасушаларымен салыстырғанда айтарлықтай артты (химотрипсинтәрізді: 48 976-дан 128 078 RLU-ға дейін; трипсинтәрізді: 12 222-ден 42 333 RLU-ға дейін; каспазатәрізді: 32 614-тен 126 628 RLU-ға дейін). Митохондрияның жасаруы кейінірек байқалды, белсенді оттегі түрлерінің деңгейі 10-шы күні айтарлықтай төмендеп, жас фибробласттардағы мәндерге сәйкес болды (p < 0,001). Бұл нәтижелер протеостаз бен митохондрия функциясының қалпына келуіндегі әртүрлі уақыт аралықтарын айқындайды. Қорытынды. OSKM-нің уақытша экспрессиясы арқылы ішінара репрограммалау қартаюдағы фибробласттарда қартаюдың негізгі белгілерін тиімді түрде кері қайтара алады. Протеостаз 5 күн ішінде қалпына келеді, ал 10 күннен кейін митохондрия функционалдығы қайта қалпына келеді, бұл жасару үдерісінің бірізділігін көрсетеді. Бұл нәтижелер репрограммалауға негізделген араласуларды оңтайландыру үшін маңызды уақыттық ақпарат береді және клиникалық қолданыстағы жасарту стратегияларын әзірлеуге ықпал етеді. Введение. Старение характеризуется клеточным ухудшением, вызванным такими ключевыми процессами, как нарушение протеостаза и дисфункция митохондрий. Эти нарушения способствуют накоплению токсичных белков, окислительному стрессу и дегенерации тканей. Хотя временная экспрессия факторов репрограммирования (Oct4, Sox2, Klf4 и c- Myc; OSKM) была предложена для устранения возрастной дисфункции, точная временная динамика омоложения остаётся неясной. Цель. Исследование направлено на определение временных рамок восстановления протеостаза и митохондриальной функции в сенесцентных фибробластах человека при частичном репрограммировании OSKM. Материалы и методы. Стареющие фибробласты лёгких человека были модифицированы для экспрессии OSKM под контролем доксициклина. Восстановление протеостаза оценивали с помощью клеточного анализа Proteasome-Glo™ для измерения химотрипсиноподобной, трипсиноподобной и каспазоподобной протеасомной активности. Активность митохондрий оценивали путём измерения активных форм кислородас использованием красителя MitoSOX Red и проточной цитометрии. Данные анализировали путём сравнения индуцированных и стареющих контрольных клеток с использованием статистической обработки для установления значимости. Результаты. Индукция OSKM привела к зависящему от времени восстановлению протеостаза. К 5-му дню активность протеасом была значительно повышена в клетках, индуцированных OSKM, по сравнению со стареющими контрольными клетками (химотрипсиноподобные: от 48 976 до 128 078 RLU; трипсиноподобные: от 12 222 до 42 333 RLU; каспазоподобные: от 32 614 до 126 628 RLU). Омоложение митохондрий происходило позже: уровни активных форм кислорода значительно снижались к 10-му дню, достигая значений, сопоставимых с молодыми фибробластами (p<0,001). Эти результаты подчеркивают различные временные интервалы для восстановления протеостаза и функции митохондрий. Заключение. Частичное репрограммирование посредством транзиентной экспрессии OSKM может эффективно обратить вспять ключевые признаки старения в стареющих фибробластах. Протеостаз восстанавливается в течение 5 дней, а затем, через 10 дней, восстанавливается функциональность митохондрий, что свидетельствует о последовательном процессе омоложения. Эти результаты предоставляют важную временную информацию для оптимизации вмешательств, основанных на репрограммировании, и способствуют разработке клинически применимых стратегий омоложения.