Isorhynchophylline protects against ferroptosis in diabetic nephropathy by activating Nrf2

Diabetic nephropathy (DN) is a life-threatening complication of diabetes mellitus (DM) and the leading cause of end-stage renal disease. Ferroptosis, a novel iron-dependent mode of cell death, has been identified to participate in the pathogenesis of DN. Isorhynchophylline (IRN) is a tetracyclic indole oxide alkaloid present in Uncaria rhynchophylla (Rubiaceae), which shows protective effects against diabetic encephalopathy and acute kidney injury. Our study intends to determine whether IRN ameliorates DN progression through inhibiting ferroptosis. The db/db diabetic mice and high glucose (HG)-stimulated human kidney tubular epithelial HK-2 cells were used to explore the potential therapeutic value of IRN in vivo and in vitro . Blood glucose levels, body weight, kidney weight, serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), and albumin-to-creatinine ratio (UACR) were detected to assess diabetic symptoms and renal functions in db/db mice. Hematoxylin–eosin (H&E) and periodic acid-Schiff staining (PAS) staining were performed to observe renal pathohistological changes in diabetic mice. Iron contents as well as malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) in mouse tissue homogenates and HK-2 cell supernatants were examined to assess iron accumulation and oxidative stress. The levels of ferroptosis-related proteins and Nrf2/HO-1 signaling-related proteins as well as Nrf2 nuclear translocation in mouse renal tissues and HK-2 cells were detected by western blotting and immunofluorescence staining. IRN administration alleviated diabetic symptoms and improved renal functions in diabetic mice. IRN mitigated renal histologic damage, including glomerular hypertrophy, mesangial matrix accumulation, capillary basement membrane thickening, and thylakoid stroma expansion in diabetic mice. IRN treatment inhibited ferroptosis in both diabetic mice and HG-induced HK-2 cells by reducing iron content and MDA levels, elevating GSH levels, upregulating the protein levels of FTH-1, GPX4, and SLC7A11, and downregulating the protein levels ofTFR-1 and NCOA4. Mechanistically, IRN treatment enhanced Nrf2 and HO-1 protein levels and Nrf2 nuclear translocation in renal tissues of diabetic mice and HG-exposed HK-2 cells. IRN plays a renoprotective role in DN by suppressing ferroptosis, which might be ascribed to the Nrf2/HO-1 pathway activation, highlighting the potential therapeutic application of IRN for DN treatment. La nefropatía diabética (ND) es una complicación potencialmente letal de la diabetes mellitus (DM), siendo la causa principal de enfermedad renal en etapa terminal. La ferroptosis, un modo nuevo de muerte celular dependiente del hierro, ha sido identificada para participar en la patogenia de la ND. Isorincofilina (IRN) es un alcaloide oxindólico tetracíclico presente en Uncaria rhynchophylla (rubiácea), que muestra efectos protectores contra la encefalopatía diabética y la lesión renal aguda. El objetivo de nuestro estudio es determinar si IRN mejora la progresión de la ND mediante la inhibición de la ferroptosis. Se utilizaron ratones diabéticos db/db y células HK-2 epiteliales de túbulo renal humano estimuladas con alta glucosa (HG) para explorar el valor terapéutico potencial de IRN in vivo e in vitro . Se detectaron los niveles glucémicos, peso corporal, peso renal, creatinina sérica (SCr), nitrógeno ureico en sangre (BUN) y ratio albúmina-creatinina (UACR) para evaluar los síntomas diabéticos y las funciones renales en los ratones db/db. Se realizaron tinciones hematoxilina–eosina (H&E) y de ácido peryódico de Schiff (PAS) para observar los cambios patohistiológicos renales en los ratones diabéticos. Se examinaron los contenidos férricos y de malondialdehído (MDA) y glutatión (GSH) en homogeneizados de tejido de ratones y sobrenadantes de células HK-2, para evaluar la acumulación de hierro y el estrés oxidativo. Se detectaron los niveles de proteínas relacionadas con la ferroptosis y las proteínas relacionadas con la señalización de Nrf2/HO-1, así como la traslocación nuclear de Nrf2 en tejidos renales de los ratones y las células HK-2 mediante inmunotransferencia y tinción por inmunofluorescencia. La administración de IRN alivió los síntomas diabéticos y mejoró las funciones renales en los ratones diabéticos. IRN mitigó el daño histológico renal, incluyendo la hipertrofia glomerular, la acumulación en la matriz mesangial, el engrosamiento de la membrana basal capilar y la expansión del estroma tilacoide en los ratones diabéticos. El tratamiento de IRN inhibió la ferroptosis tanto en los ratones diabéticos como en las células HK-2 inducidas por HG, reduciendo el contenido férrico y los niveles de MDA, elevando los niveles de GSH, aumentando los niveles proteicos de FTH-1, GPX4 y SLC7A11, y reduciendo los niveles proteicos de TFR-1 y NCOA4. Mecánicamente, el tratamiento de IRN mejoró los niveles proteicos de Nrf2 y HO-1 y la traslocación nuclear de Nrf2 en los tejidos renales de los ratones diabéticos y las células HK-2 expuestas a HG. IRN juega un papel nefroprotector en la ND, suprimiendo la ferroptosis, lo cual podría atribuirse a la activación de la vía Nrf2/HO-1, destacando la aplicación terapéutica potencial de IRN para el tratamiento de la ND.