Inter-residue through-space scalar ¹⁹ F– ¹⁹ F couplings between CH ₂ F groups in a protein

Using cell-free protein synthesis, the protein G B1 domain (GB1) was prepared with uniform high-level substitution of leucine by (2 <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"><mml:mi>S</mml:mi></mml:math> ,4 <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"><mml:mi>S</mml:mi></mml:math> )-5-fluoroleucine (FLeu1), (2 <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"><mml:mi>S</mml:mi></mml:math> ,4 <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"><mml:mi>R</mml:mi></mml:math> )-5-fluoroleucine (FLeu2), or 5,5^'-difluoroleucine (diFLeu). <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> nuclear magnetic resonance (NMR) spectra showed chemical shift ranges spanning more than 9 <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"><mml:mrow><mml:mi>ppm</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> . Through-space scalar <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi> <mml:msup><mml:mtext>-</mml:mtext> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> couplings between <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msub><mml:mi>CH</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups arising from transient fluorine-fluorine contacts are readily manifested in [ <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> , <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> ]-TOCSY spectra. The <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> chemical shifts correlate with the three-bond <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>1</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>H</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> - <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> couplings ( <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>3</mml:mn></mml:msup> <mml:msub><mml:mi>J</mml:mi> <mml:mi>HF</mml:mi></mml:msub> </mml:mrow> </mml:math> ), confirming the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"><mml:mi>γ</mml:mi></mml:math> -gauche effect as the predominant determinant of the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> chemical shifts of the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msub><mml:mi>CH</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups. Different <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>3</mml:mn></mml:msup> <mml:msub><mml:mi>J</mml:mi> <mml:mi>HF</mml:mi></mml:msub> </mml:mrow> </mml:math> couplings of different <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msub><mml:mi>CH</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups indicate that the rotation of the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msub><mml:mi>CH</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups can be sufficiently restricted in different protein environments to result in the preferential population of a single rotamer. The <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>3</mml:mn></mml:msup> <mml:msub><mml:mi>J</mml:mi> <mml:mi>HF</mml:mi></mml:msub> </mml:mrow> </mml:math> couplings also show that <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msub><mml:mi>CH</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups populate the different rotameric states differently in the 5,5^'-difluoroleucine residues than in the monofluoroleucine analogues, showing that two <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msub><mml:mi>CH</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups in close proximity influence each other's conformation. Nonetheless, the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> resonances of the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi>C</mml:mi> <mml:mrow><mml:mi>δ</mml:mi> <mml:mn>1</mml:mn></mml:mrow> </mml:msup> <mml:msub><mml:mi>H</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> and <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi>C</mml:mi> <mml:mrow><mml:mi>δ</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:mrow> </mml:msup> <mml:msub><mml:mi>H</mml:mi> <mml:mn>2</mml:mn></mml:msub> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> groups of difluoroleucine residues can be assigned stereospecifically with good confidence by comparison with the <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> chemical shifts of the enantiomerically pure fluoroleucines. <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi></mml:mi> <mml:mn>1</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>H</mml:mi> <mml:msup><mml:mtext>-</mml:mtext> <mml:mn>19</mml:mn></mml:msup> <mml:mi>F</mml:mi></mml:mrow> </mml:math> nuclear Overhauser effects (NOEs) observed with water indicate hydration with sub-nanosecond residence times.