Mechanistic insights into the inhibitory effect of CDK5 on melanin synthesis in melanocytes via a CDC42-MITF signaling pathway

摘要： 【摘要】 目的 探讨细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）调控细胞分裂周期蛋白42（CDC42）-小眼畸形相关转录因子（MITF）信号通路在黑素细胞黑素合成机制中的作用。方法 在健康人永生化黑素细胞系（PIG1）中分别过表达或敲低CDK5表达，分为①对照组：仅用转染试剂处理；②空载转染组：转染空载体质粒；③CDK5转染组：转染CDK5过表达质粒；④si-CDK5组：转染CDK5 siRNA；⑤si-NC组：转染阴性对照siRNA；RT-qPCR和Western印迹法分别检测PIG1中CDK5、CDC42、MITF mRNA和蛋白的表达，多巴氧化法和氢氧化钠裂解法分别检测酪氨酸酶（TYR）活性和黑素含量。PIG1中敲低CDC42表达的实验中，设置①si-CDC42组：转染CDC42 siRNA；②si-NC组：转染阴性对照siRNA，采用上述方法检测CDK5和MITF mRNA和蛋白的表达，检测TYR活性、黑素含量。收集10例白癜风患者皮损组织作为白癜风组，10例黑素细胞痣或皮脂腺囊肿旁正常皮肤组织作为对照组，采用免疫荧光和Western印迹法检测皮肤组织中CDK5和CDC42的定位及表达。多组计量资料的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，两独立样本间比较采用两独立样本t检验。结果 RT-qPCR和Western印迹结果显示，PIG1中过表达CDK5后，CDK5转染组CDK5、CDC42和MITF mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组和空载转染组（均P < 0.001）。PIG1中抑制CDK5表达后，si-CDK5组CDC42和MITF蛋白表达水平（0.40 ± 0.05、0.42 ± 0.02）明显低于si-NC组（1.00 ± 0.31、1.00 ± 0.29），t = 3.35、3.47，P = 0.029、0.026；同时，si-CDK5组TYR活性及黑素含量（0.67 ± 0.03、0.60 ± 0.03）均明显低于si-NC组（1.00 ± 0.20、1.02 ± 0.25），t = 2.90、2.85，P = 0.044、0.047。PIG1中抑制CDC42表达后，si-CDC42组CDK5 mRNA和蛋白的表达水平与si-NC组相比差异无统计学意义（均P > 0.05）；si-CDC42组MITF mRNA和蛋白的表达水平均显著低于si-NC组（P = 0.003、< 0.001）；si-CDC42组TYR活性、黑素含量均明显低于si-NC组（P = 0.034、0.037）。免疫荧光染色结果显示，CDK5和CDC42在人正常皮肤组织的黑素细胞中大量表达。Western印迹结果显示，对照组CDK5和CDC42蛋白表达量均明显高于白癜风组（均P < 0.05）。结论 CDK5可能通过CDC42-MITF信号通路促进黑素细胞中TYR活性增强和黑素生成。白癜风皮损中黑素细胞CDK5、CDC42表达均降低。