Automated <scp>FRET</scp> Two‐Hybrid Analysis

The fluorescence resonance energy transfer (FRET) two-hybrid assay enables live-cell detection of biomolecular complexes but faces high-throughput screening (HTS) limitations due to laborious image analysis. We developed an automated platform using the Luminance-Uniformity-based Region of Interest Selection (LURS) algorithm, accelerating processing 12-fold (6 h <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:semantics><mml:mrow><mml:mo>→</mml:mo></mml:mrow> </mml:semantics> </mml:math> 30 min) for three-channel FRET imaging. Validation with FRET standards (C32V: <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:semantics> <mml:mrow><mml:msubsup><mml:mi>E</mml:mi> <mml:mi>D</mml:mi> <mml:mrow><mml:mi>C</mml:mi> <mml:mn>32</mml:mn> <mml:mi>V</mml:mi></mml:mrow> </mml:msubsup> <mml:mo>=</mml:mo> <mml:mn>0.30</mml:mn> <mml:mo>±</mml:mo> <mml:mn>0.01</mml:mn></mml:mrow> </mml:semantics> </mml:math> , <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:semantics> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi>S</mml:mi> <mml:mrow><mml:mi>C</mml:mi> <mml:mn>32</mml:mn> <mml:mi>V</mml:mi></mml:mrow> </mml:msup> <mml:mo>=</mml:mo> <mml:mn>1.06</mml:mn> <mml:mo>±</mml:mo> <mml:mn>0.14</mml:mn></mml:mrow> </mml:semantics> </mml:math> ; CVC: <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:semantics> <mml:mrow><mml:msubsup><mml:mi>E</mml:mi> <mml:mi>D</mml:mi> <mml:mi>CVC</mml:mi></mml:msubsup> <mml:mo>=</mml:mo> <mml:mn>0.40</mml:mn> <mml:mo>±</mml:mo> <mml:mn>0.02</mml:mn></mml:mrow> </mml:semantics> </mml:math> , <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:semantics> <mml:mrow><mml:msup><mml:mi>S</mml:mi> <mml:mi>CVC</mml:mi></mml:msup> <mml:mo>=</mml:mo> <mml:mn>1.90</mml:mn> <mml:mo>±</mml:mo> <mml:mn>0.11</mml:mn></mml:mrow> </mml:semantics> </mml:math> ) matched reference values. Applied to Bcl-xL/Bak interactions under A1331852 treatment, LURS revealed dose-dependent stoichiometry reduction ( <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML"> <mml:semantics><mml:mrow><mml:mn>1.87</mml:mn> <mml:mo>→</mml:mo> <mml:mn>1.12</mml:mn></mml:mrow> </mml:semantics> </mml:math> ). The method achieved precise signal extraction while preserving native cellular conditions, overcoming throughput constraints in dynamic protein interaction studies.