Fusarium oxysporum Tolerance assay in Strawberry (Fragaria x ananassa) Varieties and Analysis of FaPAL Gene Expression in an In vitro System

Abstract. Strawberry (Fragaria x ananassa) is one of the most commercially important fruits worldwide, and produces nutraceuticals flavonoids as pelargonidin, and other important antioxidants like quercetin and kaempferol. In Mexico, several strawberry varieties have been developed looking for more resistant plants to different pathogens like Fusarium oxysporum. Phenolics and flavonoids have been recognized as part of the defense mechanism of plants. These compounds arise from phenylalanine ammonia lyase (PAL) enzyme activity and strawberry contains several FaPAL genes; however, most publications don’t specify which one is being analyzed, or they are used interchangeably. Although FaPAL1, FaPAL2 and FaPAL6 have been isolated, no expression differences nor analysis of their promoters have been done. In this work we use an in vitro system to analyze the putative Fusarium oxysporum tolerance of ‘Camino Real’ and ‘Nikté’ strawberry cultivars grown in Mexico. Phenotypical traits, phenolics and flavonoids from control and infected plants were analyzed. We also made a bioinformatic analysis of the FaPAL genes from complete and partial cDNAs, and genomics comparisons. The two FaPAL gene families were recognized. Cis-active elements were analyzed in the promotor regions of both FaPAL gene families and the specific expression of FaPAL1 and FaPAL2 genes was analyzed in comparison with defensive genes like FaMBL1, FaWRKY1, FaCyf1, FaChi3, and FaPR1, upon the application of chitosan and beta-aminobutyric acid (BABA) as elicitors. Specific responses were related to FaEF1-alfa and FaGAPDH2 as optimal reference genes. We found that FaPAL1 and FaPAL2 responded strongly to chitosan, and BABA response suggest a downregulation of FaPAL1. Resumen. La fresa (Fragaria x ananassa) es una de las frutas de mayor importancia comercial a nivel mundial, y produce flavonoides nutracéuticos como la pelargonidina y otros importantes antioxidantes como la quercetina y el kaempferol. En México se han desarrollado diversas variedades de fresa buscando plantas más resistentes a diferentes patógenos como Fusarium oxysporum. Los fenólicos y flavonoides han sido reconocidos como parte del mecanismo de defensa de las plantas. Estos compuestos surgen de la actividad de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) y la fresa contiene varios genes FaPAL; sin embargo, la mayoría de las publicaciones no especifican cuál se está analizando o se usan indistintamente. Aunque se han aislado FaPAL1, FaPAL2 y FaPAL6, no se han realizado análisis de diferencias de expresión ni de sus promotores. En este trabajo utilizamos un sistema in vitro para analizar la supuesta tolerancia a Fusarium oxysporum de los cultivares de fresa ‘Camino Real’ y ‘Nikté’ cultivados en México. Se analizaron rasgos fenotípicos, fenólicos y flavonoides de plantas control e infectadas. También realizamos un análisis bioinformático de los genes FaPAL a partir de ADNc completos y parciales, y comparaciones genómicas. Se reconocieron las dos familias de genes FaPAL. Se analizaron elementos activos cis en las regiones promotoras de las dos familias de FaPAL1 y se analizó la expresión específica de los genes FaPAL1 y FaPAL2 en comparación con genes defensivos como FaMBL1, FaWRKY1, FaCyf1, FaChi3 y FaPR1, tras la aplicación de quitosano y ácido beta-aminobutírico (BABA) como inductores. Las respuestas específicas se relacionaron con FaEF1α y FaGAPDH2 como genes de referencia óptimos. Encontramos que FaPAL1 y FaPAL2 respondieron fuertemente al quitosano, y la respuesta de BABA sugiere una regulación negativa de FaPAL1.