Optimal conditions for studying the effects of platelet-rich plasma in vitro on the culture of dermal fibroblasts

Objective. To study the effects of platelet-rich plasma (PRP) in vitro on the culture of dermal fibroblasts depending on the plasma concentration in the medium, method of activation, and cell density. Material and methods. To prepare PRP, we used one of the classic protocols for one-step centrifugation of blood from healthy donors (n=4). The study included series with different cell densities (hTERT-HDFa – d220 cell line): 2500/well, 5000/well and 10000/well – 96-well plate). Activated donor PRP was added to the experimental wells at the concentrations of 10.0%, 5.0%, 2.5%. We used freeze-thaw cycle as a control activator, with a series of experiments with additional activation using 10% CaCl2 (20 l/ml). We analyzed cell survival and metabolic activity with the MTT test. The evaluation of fibroblast migration activity was done in a scratch assay. The assessment of cell morphology and the determination of cell death mechanisms were conducted using fluorescent microscopy with preliminary staining of samples. StatTech v. 4.1.7 was used for statistical analysis. Results. The viability assessment of the hTERT-HDFa cells with different cell densities demonstrated the maximum metabolic activity of human skin fibroblasts at an initial planting density of 2500–5000 thousand cells per well (25 000–50 000/ml), and a decrease in cell growth intensity with increasing density. The optimal cell viability values were reached after 72 hours of observation. The effect of PRP activation with CaCl2 supplementing the freeze-thaw cycle before addition to the medium on fibroblast viability was negligible. In the scratch assay, the defect area closed faster with PRP used at the concentrations of 5–10%. Conclusion. To assess the biological effects of PRP on human skin fibroblast culture, we recommend to use a 5–10% concentration of the activated sample in the culture medium; the optimal planting density for this cell culture is 25 000–50 000 cells/ml. Цель исследования: изучить действие обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) in vitro на культуру клеток дермальных фибробластов в зависимости от ее концентрации в среде, способа активации, плотности посадки клеток. Материал и методы. Для приготовления PRP использовали один из классических протоколов одноэтапного центрифугирования цельной крови здоровых доноров (n=4). Исследование проводили при разной плотности клеток (клеточная линия hTERT-HDFa – d220): 2500 кл./лунка, 5000 кл./лунка и 10 000 кл./лунка – 96-луночный планшет). В опытные лунки вносили активированную PRP доноров в концентрациях 10,0%, 5,0, 2,5%. В качестве контрольной активации использовали цикл «замораживание-размораживание», с серией экспериментов с дополнительной активацией 10% CaCl2 (20 л/мл). Анализ выживаемости и метаболической активности клеток проводили с помощью МТТ-теста. Миграционную активность фибробластов исследовали в ране in vitro (scratch assay). Морфологическую оценку клеток и определение механизмов клеточной гибели проводили при помощи флуоресцентной микроскопии с предварительной окраской образцов. Статистический анализ (StatTech v. 4.1.7). Результаты. Оценка жизнеспособности клеток линии hTERT-HDFa в зависимости от плотности посадки клеток продемонстрировала, что максимальная метаболическая активность фибробластов кожи человека отмечается при первоначальной плотности посадки 2,5–5,0 тыс. клеток на лунку (25–50 тыс./мл), при увеличении плотности отмечается снижение интенсивности роста культуры. Оптимальные показатели жизнеспособности клеток регистрируются через 72 часа наблюдения. Влияние дополнительной к «замораживанию-размораживанию» активации CaCl2 PRP перед внесением в среду на жизнеспособность фибробластов оказалось несущественным. Результаты изучения раны in vitro показали, что область дефекта закрывается быстрее при использовании PRP в концентрациях 5–10%. Заключение. На основании оценки результатов воздействия PRP на культуру фибробластов кожи чело- века рекомендуется использовать 5–10% концентрацию активированного образца в культуральной среде, оптимальная посадочная плотность для данной культуры 25–50 тыс. кл./мл.